《脲酶Km值测定》PPT课件

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1、实验三脲酶的Km值简易测定1926年，美国生化学家Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，并证明了脲酶的本质是蛋白质。1946年获得诺贝尔化学奖。酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。酶的特征常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度酶促反应的特征常数只与酶的结构、底物和反应环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。实验目的阐述酶促反应中特征常数的特点和意义；说出利用比色法进行Km值测定的整个操作步骤；思考Km值的测定对临床工作中的意义。一、原理OCNH2NH2+2H2O脲酶（NH4）2CO3

2、+6NaI+8KI+Na2CO3+6H2O(NH4)2CO3+8H2O+4(KI)2HgI22OHgHgNH2I碘化双汞铵（橙黄色）米—曼氏方程（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米-曼氏方程解释：当[S]Km时，v＝Vmax[S]/Km，即v正比于[S]当[S]Km时，v≈Vmax,即[S]而v不变Km值：当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol／L。Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。Km+[S]Vmax[S]V2Vmax=Km=[S]=底物浓度对酶促反应速度的影响vVmV

3、m20[S][S]与v关系：当[S]很低时，[S]与v成比例--一级反应当[S]较高时，[S]与v不成比例当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应Km值与Vmax值测定双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）1=Km1+1VVmax[S]Vmax1/V-1/Km01/[S]斜率=Km/Vmax1/Vmax酶促反应的原料底物（脲液）酶（脲酶液）酶促反应所需的缓冲液（PBS，蒸馏水等）酶促反应发生的环境（碱性条件，加入NaOH；温度，37℃）操作中每种试剂务必摇匀煮沸脲液时注意试管口不能对人，变性脲酶液要煮沸变性彻底试管一定要清洗干净，防止其他残留液体对

4、实验的影响各组试管加样注意一致性，防止人为加样造成的误差。重复测值，取平均数值注意事项实验操作管号1234对照脲液加入体积(mL)0.20.1340.10.080.081/15PB（mL）0.60.6660.70.7200.720脲酶液（mL）0.20.20.20.2--煮沸脲酶液（mL）----0.2摇匀，37度水浴15min100g/LZnSO40.50.50.50.50.5蒸馏水333330.5mol/LNaOH0.50.50.50.50.5滤液/mL11111蒸馏水/mL22222显色液/mL0.750.750.750.750.75充分摇匀，静置5min，

5、过滤，分别在滤液中加入以下试剂迅速摇匀，用721型分光光度计，420nm，以对照调零，测定各管A值。1/A-1/Km01/C斜率=Km/Vmax1/Vmax（1/V）讨论小结酶促反应有什么特点？测定酶促反应特征常数Km值有意义？思考题：1、脲酶的特征常数的特点是什么？2、测定Km值有什么意义？3、Km值的测定与临床疾病有何联系？