高效液相色谱法进展及其在卫生检验中的应用孙成均

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1、四川大学华西公共卫生学院孙成均高效液相色谱技术进展及其在卫生检验中的应用介绍的主要内容概述高效液相色谱仪组成及进展从色谱图的异常推测故障高效液相色谱法在卫生检验中的应用一、概述高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代发展起来的一种分离分析技术，在色谱技术中应用最广。据估计，世界上数百万种有机化合物中除20%宜用气相色谱法(GC)分离分析外，其余80%（包括大分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物）均可用HPLC分离分析。自1980年代以来，HPLC成为国际分析化学界发展最快的一种分离分析技术，在工农业、医药卫生、环

2、境监测等众多领域有广泛应用。液相色谱的发展简史1903年，俄国植物学家Tswett在华沙大学研究植物叶组成时，用碳酸钙作吸附剂分离植物叶石油醚萃取物；是最早的液固色谱法。1931年，德国Kuhn和Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了α，β和γ－胡萝卜素；此后用这种方法分离了60余种这类色素；1970年代初；高压泵和化学键合固定相结合，出现高效液相色谱；1970年代末，出现反相色谱柱；1980年代得到广泛应用；1980年代末，出现毛细管超临界流体色谱和毛细管电泳。液相色谱基本原理溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固

3、定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。分离原理示意图慢中等快淋洗液二、高效液相色谱仪组成及进展HPLC仪器一般由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和计算机控制及数据处理系统(工作站)组成。1．输液系统对高压输液泵的要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求；可调范围宽，既能满足微柱(内径1～2mm)分析，也能满足常规柱(内径4mm)分析，甚至还可满足半制备柱(内径10mm)的需

4、求。目前HPLC常用的是双泵头往复式柱塞泵，流速范围一般为0.001～10ml/min。它是由两个泵头交替工作来保证系统中液流不中断。往复式柱塞泵洗脱方式等度洗脱（IsocraticElution）：溶剂组成恒定，在整个洗脱过程，流动相极性保持恒定。梯度洗脱（GradientElution）：流动相组成和极性随洗脱过程而改变。流动相组成变化对保留时间的影响等度洗脱分离芳香化合物色谱条件：色谱柱为250mm×4.6mm，5umHypersilODS柱温：22℃；流动相A为缓冲液（25mMKH2PO4＋0.1g/LNaN3，pH3.5）；B为乙腈。

5、峰1、苯甲醇；峰2、苯酚；峰3、3,4-二羟基-氯代苯乙酮；峰4、安息香胶；峰5、苯甲酸乙酯；峰6、甲苯；峰7、2,6－二甲氧基甲苯；峰8、间－甲氧基联苯泵的保养与维护高纯流动相（甲醇、乙腈、水、缓冲盐等）；流动相进液砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。2．进样六通阀美国Rheodyne进样阀HPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器应用

6、最广。进样六通阀使用注意事项手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，转到进样位时，高压力引起柱头损坏，故应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。该针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性好，不漏液，不引入空气；还可防止了针头刺坏密封组件及定子。对进样液的要求样液要无微粒杂质样液，一般要经0.45μm滤膜过滤或高速离心。以防堵塞针头及进样阀，减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相

7、冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗。3.色谱柱色谱柱通常为不锈钢柱，内装不同填充剂。常用填料为硅胶，可用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相色谱或正相色谱。其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS柱（octadecylsilicacolumn），可用于反相色谱或离子对色谱。高效液相色谱柱发展史1970年代，HPLC柱面世，主要填料：10µm的无定型硅胶颗粒。1970年代后期，发展了反相液相色谱。1980年代，HPLC已广泛应用，主要填料粒径5～10µm球形硅胶。1990年代早期，发展了粒径为5µm的高纯硅

8、胶（B型硅胶），其含有微量的金属（A型硅胶含有高含量金属）。1990年代后期，发展了3µm或3.5µm的球形硅胶。2000年后，为适应超快速分离要求，