染色体步行PCR技术

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1、应用与环境生物学报2006,12(3):427~430ChinJApplEnvironBiol=ISSN10062687X2006206225*染色体步行PCR技术**王闵霞马欣荣王天山谭红(中国科学院成都生物所成都610041)摘要染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术.本文综述了现有的染色体步行PCR技术,如反向PCR、锅柄PCR、连接介导PCR、热不对称PCR、SONPCR等,并在此基础上提出了一种新的染色体步行PCR技术的构思.它运用特异引物与随机引物的搭配,在普通PCR程序下扩增目的序列.实验中设置相应随机引物的RAPD对照,识别非目的扩增产物.文

2、中介绍了新方法的原理,分析了这种方法的优缺点.这种方法可能是一种新的有效进行染色体步行的PCR技术,国内外尚未见相关报道.图2参26关键词染色体步行;特异引物;随机引物;新技术CLCQ78*PCRTechniquesforChromosomeWalking**WANGMinxia,MAXinrong,WANGTianshan&TANHong(ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,Chengdu610041,China)AbstractChromosomewalkingtechniquesarecommon

3、lyusedforcloningtheknownflankingsequence.ThispaperreviewstheexistingchromosomewalkingPCRtechniques,suchasinversePCR,panhandlePCR,ligationmediated(LM)PCR,ther2malasymmetricinterlaced(TAIL)PCRandsingleoligonucleotidenested(SON)PCR,andalsoputsforwardanewchromo2somewalkingmethod.Usingthisme

4、thodtheobjectiveproductsareamplifiedundercommonPCRproceedingwithparticularprimerandrandomprimer.Comparisonexperimentswithcorrespondingrandomprimerpairsareconductedtoidentifythenon2objectiveproducts.Thismethodmaybeanewandeffectivetechniqueforchromosomewalking.Fig2,Ref26Keywordschromosome

5、walking;particularprimer;randomprimer;newtechniqueCLCQ78[1]克隆基因,寻找已知基因的启动子和调控元件,研究基引物和4种dNTP等存在的条件下,依赖于DNA聚合酶(Taq[2]因的内含子和外显子边界,探知特定位点的上游和下游序酶)的酶促合成反应.通过变性)退火)聚合循环反应,PCR[3]列,分析转基因生物基因组中外源基因的插入位点,都要依产物以指数形式扩增,经25~30次循环PCR产物量可达2@6~7靠染色体步行(chromosomewalking)技术.染色体步行是指由10拷贝数.自1985年美国Centus公

6、司的Mullis发明PCR技生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻术以来,PCR技术凭其自身快速、灵敏的优势,已经成为一种的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列核苷酸组成常规的克隆基因的方法和手段.[4]的方法和过程.经典的染色体步行方法比较烦琐,适合于长基于PCR的染色体步行技术也发展起来,在普通PCR方距离步行,而基于PCR的染色体步行技术则相对比较简便,适法获得基因部分序列的基础上,通过染色体步行获得基因全合于短距离步行.长.反向PCR(inversePCR)、锅柄PCR(panhandlePCR)、载体我们做了几种染色体步行PCR方法的实验,

7、没有成功.受介导的PCR(vectorettePCR)、连接介导PCR(ligationmediated[5]TAIL2PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)技术的启发,PCR)和捕获/寡盒介导PCR(capture/oligocassettemediated构思了一种新的染色体步行PCR方法,现阐释这种PCR方法PCR)等就是建立在PCR技术基础上的染色体步行技术,为扩的原理等问题.增已知序列旁侧的未知DNA片段提供了捷径.这些方法的建立可以不必经过烦琐的建库和筛选过程而获得全长基因序列.1PCR基本原理及现有的基于