人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

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1、人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定栗炳南，李卫东，林俊堂，丰慧根新乡医学院生命科学技术学院，河南省新乡市 453003ConstructionandidentificationofpIRES2-GDNF-VEGF165bicistroniceukaryoticexpressionvectorLiBing-nan,LiWei-dong,LinJun-tang,FengHui-genDepartmentofLifeSciencesandTechnology,Xinx

2、iangMedicalUniversity,Xinxiang453003,HenanProvince,China摘要 背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)和血管内皮生长因子165(vascularendothelialgrowthfactor165，VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-VEGF165并对其进行鉴定。方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DN

3、A中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因，然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定

4、，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示，提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，相对分子质量分别为636bp和576bp。构建的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体经BglII/BamHI切出GDNF条带，经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段，经BglII/NotI双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF165片段。RT-PC

5、R与Western-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程全文链接：窗体顶端关键词：组织构建；组织工程；胶质细胞源性神经营养因子；血管内皮生长因子165；真核双表达载体；内部核糖体进入位点；转染；双PCR；  A

6、bstract：BACKGROUND:Humanglialcellline-derivedneurotrophicfactor(GDNF)andvascularendothelialgrowthfactor165(VEGF165)areessentialgenesforcelldifferentiation.OBJECTIVE:ToconstructandidentifypIRES2-GDNF-VEGF165bicistroniceukaryoticexpressionvector.METHODS:Huma

7、nGDNFgeneswereobtainedfromthegenomicDNAofhumanperipheralbloodmononuclearcellsbyPCR.ThentheGDNFcDNAfragmentwasinsertedintothemultiplecloningsitesofpIRES2-EGFP,togeneratethebicistroniceukaryoticexpressionplasmidpIRES2-GDNF-EGFP.TheVEGF165genewasobtainedfromp

8、IRES2-VEGF165-EGFPplasmidbytwinPCR.ThenVEGF165cDNAfragmentwasclonedintothepIRES2-GDNF-EGFP,insteadofEGFP,tocreateadoublegeneco-expressingvectorplasmidpIRES2-GDNF-VEGF165containinginternalribosomeentrysites.Th