SDS-PAGE原理、方法详解

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)一、材料准备(1)丙烯酰胺单体(Arc):在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺(2)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis):交联剂(3)10%十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,可与蛋白质结合,形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷,当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。配制方法:10gSDS,用双蒸水溶解并定容至100ml,室温保存。(4)10%过硫酸铵(Ap):引发剂。配制方法:0.1g过硫酸铵溶解于

2、1ml双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解,应新鲜配制。(5)N、N、N’、N’-四甲基乙二胺(TEMED):其碱基催化AP产生氧自由基,激活单体形成自由基,发生聚合。配制方法:原液使用。应使用电泳级TEMED。(6)30%丙烯酰胺凝胶贮液(Arc-Bis贮液)配制方法(50mL体系):14.55g丙烯酰胺+0.45gN,N-甲叉双丙烯酰胺,先用40ml双蒸水溶解,搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至50ml,0.45μm滤膜过滤。用棕色瓶储存于4℃(丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应,会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸,

3、储存液应测定pH值不超过7.0。丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存,每隔数月须重新配制。丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性,并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量时必须戴手套和面具。)(7)分离胶缓冲液(pH8.8的Tris-HCl缓冲液):1.5MTris-HCl,pH8.8。配制方法:9.08gTris溶解在40ml双蒸水中,用4mol/L盐酸调节pH值8.8,再用双蒸水加至50ml。4℃保存。(8)浓缩胶缓冲液(pH6.7的Tris-HCl缓冲液):1.0MTris-HCl,pH6.8。配制方法:6.06gTris溶解在40

4、ml双蒸水中,用4mol/L盐酸调节pH值6.8,再用双蒸水加至50ml。4℃保存。(9)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液:125mMTris,1.25M甘氨酸,0.1%(m/v)SDS,pH8.3。配制方法:在900ml去离子水中溶解15.1gTris和94g甘氨酸(电泳级)(pH8.0),然后加入50ml10%SDS(电泳级)或5gSDS,用去离子水补至1000ml。(10)1×SDS样品缓冲液:50mMTris-Cl(pH6.8),100mMDTT,2%(m/v)SDS,0.1%(m/v)溴酚蓝,10%(v/v)甘油。不含DT

5、T的1×SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M的贮存液,临用前加入。(5×SDS样品缓冲液:250mMTris-HCl(pH6.8),500mMDTT,10%(m/v)SDS,0.5%(m/v)溴酚蓝,50%(v/v)甘油。不含DTT的5×SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M的贮存液,临用前加入。)(11)考马斯亮蓝染色液:将0.25g考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)R-250溶解在90ml甲醇:水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中,用滤纸过滤,室温保存。(12)脱色液配制方法:90ml甲

6、醇:水(1:1)溶液和10ml冰醋酸的混合液。(13)蛋白质分子量标准物(marker)二、原理三、步骤(1)按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。(2)装配好后,可加水检查是否密封,防止漏胶。(1)确定凝胶浓度体积,按附注1.配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯中。(2)小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,灌到距短玻璃板顶端约3cm处。注意:为浓缩胶留有足够空间(分离胶面距加样孔底1cm,即梳齿长再加1cm。)(3)轻轻在顶层加入几毫升覆盖物(无水乙醇、去离子水或正丁醇),以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。(4)分离胶充分聚

7、合。时间约30~60min,聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。(5)倒掉覆盖层,用无离子水洗凝胶上部数次,尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液体。(6)按附注2.配制5%浓缩胶,并注入分离胶上端,插入梳子。插入梳子时要小心避免梳子顶端留有气泡。(7)浓缩胶充分聚合,时间30~60min。(8)浓缩胶聚合好后,将制胶装置从基座上取下,放如电泳槽中。(9)上下槽均加入新鲜Tris-甘氨酸电极缓冲液(至少负极槽使用新鲜电泳缓冲液)。(10)小心拔出梳子,若孔间隔离凝胶条倾斜,用小号注射器针头扶正。(11)用电泳缓冲液冲洗梳孔

8、。(12)样品准备:样品中加入50~100μl1×SDS样品缓冲液使之溶解,使浓度为0.5~1mg/mL,并沸水浴3~5min,室温下冷却。同样准备蛋白质分子量标准物。(13)上样。用微量注射器小心将15μl蛋白样品加到样品槽底部。电极缓冲液为Tr

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