石榴果皮褐变实验方案16-2-23

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1、果皮褐变指数果皮失重率和平均散失速率的测定失重率采用称量法，每个样品50g,重复称量3次，取其平均值。失重率（%）=（不同时间样品质量-样品初质量）/样品初质量×100%平均散失速率（%/d）=失重率/存放时间；其中%为散失百分率；d为存放时间（d）1.‘玉石籽’褐变过程中酶促褐变相关酶活性的变化褐变过程中PPO，POD等活性变化。（1）PPO酶活性测定方法①石榴果皮PPO酶液的提取取石榴果皮0.5g，置于研钵中，加入5mL4℃下预冷的pH7.0的磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10mmol/L的抗坏血酸）和少量石英砂，冰浴研磨成匀浆，4℃下12000r.min-1离心20min

2、,上清液即为PPO和POD粗提液，4℃保存备用。②PPO活性测定参考张立华等（2007）的方法并改进，向反应管中加入2.95ml(邻苯二酚，浓度为0.2mol/L)，于25℃水浴中平衡3min，取出试管，向其加中加50μL粗酶提取液（以煮过失活的酶液为对照），使用410nm波长处进行酶动力学分析，立即计时，扫描随后2min内溶液在410nm处的吸光度变化，每30s读数一次，共记录5次，然后以每分钟内A410变化0.01为一个酶活性单位(U)。每个样品重复测定3次，取其平均值。③PPO活性计算公式:（2）果皮过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚比色法。POD活性测定参考印芳等(2

3、008)的方法并改进：取上述粗酶液50μL与2.95mLPOD反应液(0.125mL愈创木酚+0.255mL30%H2O2，用pH7.0磷酸缓冲液稀释至250mL)，使用紫外分光光度计在470nm波长下比色，每隔1min记录1次吸光度，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位(U)。每个样品重复测定3次，取其平均值。酶活性=(△A470×VT)/(W×VS×0.01×t)。(2)式(2)中，△A470为470nm条件下，反应时间内吸光值的变化；VT为酶液总体积(mL)；W为试验材料鲜质量(g)；VS为测定时所取的酶液体积(mL)；t为反应时间(min);酶活性

4、单位为U·min-1g-1FW酶活测定所需试剂配制方法：（1）pH7.0的磷酸缓冲液：参照植物生理学实验指导用书配制。（2）pH7.0的磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10mmol/L的抗坏血酸）：1000ml的pH7.0磷酸缓冲液中加入10g聚乙烯吡咯烷酮和1.761g抗坏血酸溶解即可。(3)0.2mol/L邻苯二酚溶液称取11g邻苯二酚用500mLpH=7.0的磷酸缓冲液溶解。(4)POD反应液0.125mL愈创木酚+0.255mL30%H2O2，用pH7.0磷酸缓冲液稀释至250mL.测定酶促反应底物含量变化2.果皮总酚含量取1g石榴果皮研磨成匀浆，加入20ml60%的乙醇

5、于50ml三角烧瓶中，超声波60℃提取40min，后过滤至25ml容量瓶并定容（60%的乙醇）测定时取1ml0.5mol/L的福林酚试剂加入50微升提取液振荡混匀，再加入4ml0.5mol/L的Na2CO3溶液室温下反应60min，后于750nm比色测定其吸光值A750。以没食子酸为标准制作标准曲线。果皮总酚测定所需试剂配制方法：（1）60%的乙醇：取60ml纯乙醇用蒸馏水定容至100ml即可。（2）0.5mol/L的福林酚：购买福林酚（酚测定2mol/L）用蒸馏水稀释至0.5mol/L.(3)0.5mol/LNa2CO3：称取53gNa2CO3加蒸馏水定容至1000ml。（4）没

6、食子酸为标准制作标准曲线:精密称取没食子酸标准品0.010g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得浓度为0.1mg/mL，取此溶液5mL定容到10mL,浓度为0.05mg/mL。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL于10mL容量瓶中，分别加入福林酚试剂1mL，混匀，在0.5～8min内加入4mL0.5mol/L的Na2CO3溶液，充分混合后定容，室温下放置60min，以空白试剂为对照，750nm下测定吸光值，每个样品平行测定三次。由吸光值对浓度回归，求得标准曲线。3.DPPH自由基清除法测定抗氧化活性取2方法制备的酚类物质提取液

7、2.0ml，再加入0.8mmol/LDPPH试剂2.0mL,强烈振荡后静置30min，以无水乙醇为空白，于517nm处测定反应液的吸光度值。按下式计算DPPH清除率：DPPH清除率（%）=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100Ai为提取液与DPPH试剂混合液的吸光值；Aj为提取液与无水乙醇混合液的吸光值；Ao为DPPH试剂与无水乙醇混合液的吸光值。试剂制备方法：0.8mmol/LDPPH：准确称取0.0315gDPPH，用无水乙醇溶解，并定量转入100mL容量瓶中，摇匀