实验三-离心技术及酶学实验

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1、实验三离心技术及酶学实验概念生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。第一节基本原理离心力当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：相对离心力（RCF）通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，所以称为相对离心力。在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2）。

2、∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2r(rpm-revolutionsperminute为每分钟转数，r/min)低速离心时常以转速“rpm”来表示高速离心时则以“g”表示第二节离心机的主要构造和类型工业用离心机离心机制备性离心机实验用离心机分析性离心机一、制备性离心机的三类1．普通离心机：最大转速6000rpm左右2．高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min）3．超速离心机：转速可达50000～80000rpm，超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。二、转头1．角式转头2．荡平

3、式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。3．区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。4．垂直转头：其离心管是垂直放置的。5．连续流动转头：转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。三、离心管塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触

4、强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。离心管盖离心前必须盖严，配平时需带管盖重量防止样品外泄、挥发支持离心管，防止离心管变形制备性超速离心的分离方法差速沉降离心法逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进行离心，使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。用途：分离沉降系数相差较大的颗粒优点：操作简便缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活密度梯度区带离心法（区带离心法）定义：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不

5、会挤压变形保持活性缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、操作严格不易掌握五、离心操作的注意事项使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备

6、性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。离心过程中不得随意离开实验内容酶的提取及比活性测定一、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)的分离纯化及比活性测定[目的]1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法及注意事项2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。方法酶的本质：蛋白质盐析法有机溶剂沉淀法层析法电泳酶组织细胞：先破碎细胞，再用一定的试剂提取体液：直接提取方法物理方法化学方法原则制备的

7、原料初期采用、后期采用方法影响因素影响因素pH：最适pH温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷氧化：－SH对某些酶的活性必需，加入还原剂重金属离子污染：与－SH发生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，PMSF、DFP介质的极性和离子强度：疏水最稳定pH评估指标酶的纯度－－用比活性代表定义：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位表示方法：每mg蛋白质所具有酶的活性单位测定方法：①每ml样品中的蛋白质mg数②每ml样品中酶的活性单位酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。

8、酶的回收率提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随部分酶的损失。在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收率。[原理]机械破碎法制备肝匀浆匀浆液低浓度醋酸钠：低渗破膜低浓度醋酸镁：保护和稳定AKP有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂，重复离心正丁醇：沉淀部分