实验三-离心技术及物质代谢实验-xuxia.ppt

《实验三-离心技术及物质代谢实验-xuxia.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验三离心技术及物质代谢实验徐清清实验内容离心技术邻甲苯胺法测血糖含量糖酵解中间产物磷酸丙糖的鉴定酶法测定血浆胆固醇（下午）定义：离心技术（Centrifugetechnology）是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。用途：离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一。离心技术第一节离心技术的原理当一个粒子在高速旋转下会受到离心力F作用，其大小为：。m：沉降粒子的有效质量r：粒子的旋转半径，单位cmω：粒子旋转的角速

2、度离心机转速的表示方法：1.每分钟转数RevolutionsPerMinute(rpm)2.相对离心力RelativeCentrifugalForce(RCF)RCF表示实际离心力相当于地球引力的倍数，常用数字乘“g”来表示。9802rwRCF==FmgRCF=1.119×10-5×(rpm)²rrpm：每分钟转数，单位r/ming：重力加速度，约等于980cm/s²ω：单位弧度/秒（rad/s）相对离心力：沉降颗粒在离心管中所处位置也不同，则所受离心力不同。因此在描述超速离心条件时，通常用RCF代替rpm，因为它

3、可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。F=m*ω²*r沉降系数定义：沉降速度与离心力加速度的比值，即单位离心场中颗粒的沉降速度，单位为“S”。S=V/ω²r人们规定1S=1×10-13秒S=V(D-D’)/f用途：对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们。如核糖体RNA有30S亚基和50S亚基，这里的S就是沉降系数。。第二节离心机的主要类型和构造工业用离心机离心机制备型离心机实验用离心机分析型离心机制备性离心机一、制备性离心机的类型：1.普通离心

4、机2.高速冷冻离心机3.超速离心机普通离心机高速冷冻离心机超速离心机最大转速（rpm）600020000～2500050000～80000超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别.转头：包括角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头、连续流动转头离心管：包括塑料离心管、玻璃离心管、不锈钢离心管制备性离心机的主要构件：角式转头荡平式转头塑料离心管玻璃离心管首先根据待离心液体的性质及体积选用合适的离心管使用各种离心机前，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，对称放置，不得使用奇数个离心管。离心过程中不得

5、随意离开若要在低于室温的温度下离心时，提前预冷注意最高转速，不得超速使用。离心操作的注意事项二、胰岛素对血糖含量的影响及测定实验目的：通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用，即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度的改变.掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度。实验原理：1.胰岛素降血糖的机理：1)促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞；2)糖原合成↑,糖原分解↓；3)糖有氧氧化↑；4)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成↓→糖异生↓；5)激素敏感性脂肪酶↓→脂肪动员↓。2.邻甲苯胺法测血糖含量葡萄糖在浓酸溶液中（加在含

6、有硼酸的冰醋溶液中），水浴加热至100℃左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅并进行630nm波长比色测定其含量。实验方法1.胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后血糖含量的变化。1）取饥饿12小时家兔一只，记录体重。2）采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管扩张，然后用刀片纵行切开边缘耳静脉，让血液自然滴入试管中，收集约2ml，待血凝固后，分离血清。3）按家兔体重，皮下或腹腔注射1.5单位／kg胰岛素，记录注射时间，待40分钟后，用同样方

7、法取血，分离血清。4）将注射胰岛素前后的血清，分别测定血糖含量。2.血糖含量的测定：1.1）取试管四支，按下表操作试剂（ml）测定管（前）测定管（后)标准管空白管血清（前）血清（后）糖标准蒸馏水邻甲苯胺试剂0.1－－－4.0－0.1－－4.0－－0.1－4.0－－－0.14.02）混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却．3）用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值．4）计算：180目前国内医院多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。葡萄糖氧化酶法邻甲苯胺法测定血糖优点特异性强、价

8、廉、方法简单不易出现假性过高或过低,结果较可靠正常值空腹全血为3.6～5.3mM/L空腹全血为3.3～5.6mM/L注意问题二甲苯能扩血管但是它有溶血的作用，所以切开取血前要晾一会。沸水浴时注意安全；管口朝墙，防止高温溅出伤到自己。糖酵解中间产物的鉴定【实验目的】检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。【实验原理】3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮6-磷酸果糖1,6-二磷