第三部分 酶学相关实验技术

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1、温度、pH等对酶促反应速度的影响一.实验目的了解温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。二.实验原理温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下降。人体内大多数酶的最适温度在37℃左右。PH值影响酶促反应速度，是由于酶本身是蛋白质。PH不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。不同的酶最适

2、pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH值为6.8。凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激动剂。例如Cl-是唾液淀粉酶的激动剂。凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。三.试剂器材试剂⑴0.5％淀粉液⑵0.5％NaCl溶液⑶不同pH值缓冲溶液的配制:①1/15mol/LKH2PO4液：称取纯KH2PO49.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。②1/15mol/LNa2HPO4液：称取Na2HPO4·2H2

3、O11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH5.06.68.01/15mol/LKH2PO49.95.00.11/15mol/LNa2HPO40.15.00.9⑷1％CuSO4溶液器材水浴锅、电驴、比色盘、试管吸管、烧杯三.实验方法及步骤制备稀唾液：用清水漱口，含蒸馏水少许，咀嚼以刺激唾液分泌。在小漏斗中垫入一块薄薄的脱脂棉，直接将唾液吐入漏斗过滤。取过滤的唾液2ml加蒸馏水18ml混匀备用。（一）温度对酶促反应速度的影响1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试

4、剂。试管号试剂（ml）1230.5％淀粉溶液3．03．03．0PH6.6缓冲液1．01．01．0现象颜色变化2.混匀后，将1号、2号、3号试管分别置于沸水浴、温水浴（37～40℃）和冰水浴中5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向各试管中加入稀唾液1ml混匀，15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色变化并予以分析。（二）pH对酶促反应速度的影响1.取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5％淀粉液3．03．03．0PH5.0缓冲液1．0PH6.6缓冲液1．0PH8.0缓冲液1．0稀唾液1．01

5、．01．02.混匀后，将各管置于温水浴（37～40℃）中保温，此间每隔1分钟从第二管中取反应液1滴与碘混合观察颜色变化并记录。待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各试管加碘液1滴，观察颜色并解释结果。（三）激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5％淀粉液2．02．02．0PH6.6缓冲液1．01．01．0蒸馏水1．00.5％NaCl溶液1．00.5％CuSO4溶液1．0稀唾液1．01．01．02.混匀后，将各管置于温水浴（37～40℃）中保温，每隔1分钟在比

6、色盘上用碘检查第二管，待碘不变色时，冷却后分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释结果。试剂⑴0.5％淀粉液⑵0.5％NaCl溶液⑶不同pH值缓冲溶液的配制:①1/15mol/LKH2PO4液：称取纯KH2PO49.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。②1/15mol/LNa2HPO4液：称取Na2HPO4·2H2O11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH5.06.68.01/15mol/LKH2PO49.95.00.11/15mol/LNa2HPO40.15.

7、00.9⑷1％CuSO4溶液琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察一.实验目的通过实验进一步加深对竞争性抑制作用的理解。二.实验原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在无氧条件下，从琥珀酸脱下的氢可由甲烯蓝（蓝色）接受，甲烯蓝被还原成甲烯白。因此，可从加入的甲烯蓝的褪色情况来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的影响。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而

8、和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。三.试剂与器材试剂⑴0.2mol/L琥珀酸⑵0.2mol/L丙二酸⑶0.02mol/L丙二酸以上四种溶液均先用5mol/LNaOH调节至pH7，再用0