多囊卵巢综合征瘦素抵抗的分子机理研究

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1、华中科技大学同济医学院博士学位论文多囊多母巢综合征瘦素抵抗的分子机理研究华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科博士研究生：吕立群博士导师：孙永玉教授中文摘要目的对多囊卵巢综合征(Polycysticovarysyndrome，PCOS)患者瘦素水平的变化及其相关因素进行分析，探讨血清性激素、胰岛素抵抗(Insulinresistance，m)与瘦素抵抗(Leptinresistance，LR)的关系；研究PCOS患者卵泡液瘦素水平变化及与卵细胞受精率、卵裂率的关系：探讨瘦素对人卵巢黄素化颗粒细胞雌激素(E2

2、)和孕激素(P)分泌的体外影响；研究瘦素受体后信号转导分子JAK2(januskinases2)和STAT-3(signal打ansducersandactivatorsoftranscription)在PCOS的瘦素抵抗发病机制中的可能作用；寻找可能的基因突变位点，从基因功能调节方面进一步探讨PCOS瘦素抵抗的确切机理。方法1、PCOS患者62例，根据体重指数(BMI)分为肥胖PCOS组30例(BMI>24kg／m2)和非肥胖PCOS组32例(BMI<24kg／m2)。同时选择年龄和体重相匹配的62例月经规

3、律的正常妇女作为对照，根据BMl分为肥胖对照组30例和非肥胖对照组32例，用放射免疫法测定血清促黄体生成素(Luteinizingho姗one，LH)、卵泡刺激素(Folliclestimulatinghormone，FSH)、睾酮(Testosterone，T)的水平；采用ELISA法测定血清瘦素(Leptin)的浓度：采用放射免疫法测定血清华中科技大学同济医学院博士学位论文空腹胰岛素(Fastinginsulin，FIN)的浓度：采用葡萄糖氧化酶法测定血浆空腹血糖(Fastingplasmaglucose

4、，FPG)：采用HOMA(Homeostasismodelassessment，HOMA)模型计算胰岛素抵抗指数(HOMA，IR)。2、留取行ⅣF．ET治疗的PCOS患者(PCOS组，n=32例)和因输卵管因素不孕妇女(对照组，n=32例)的卵泡液．利用ELISA法和RIA法分别测定卵泡液瘦素浓度和内分泌指标，观察并记录两组卵细胞受精率、卵裂率。3、将来自体外受精．胚胎移植(IVF．ET)的卵巢黄素化颗粒细胞纯化后，在不同的浓度瘦素(0、lO、20、100ng／m1)和FSH(0、1、5、10IU／m1)单独

5、或联合作用下进行体外培养48小时，收集培养液，用放射免疫方法测定颗粒细胞产生E2及P的浓度。4、应用免疫沉淀技术及增强化学发光法(Enhancedchemiluminescence．ECL)检测PCOS患者和正常对照组脂肪组织中JAK2和STAT3蛋白质的酪氨酸磷酸化程度，并进行半定量分析；采用免疫沉淀、薄层层析及Y液闪计数方法检测JAK2激酶的活性，并进行分析。5、应用聚合酶链反应．单链构象多态性(PCR．singlestrandconformationpolymorphism，PCR·SSCP)银染技术结

6、合DNA直接测序，检测PCOS患者及正常对照组的腹壁脂肪组织中瘦素受体(LEPR)基因第2、4、6、7、8、13／14、20外显子的基因突变。结果1、肥胖PCOS组血清瘦素水平明显高于非肥胖PCOS组和对照组(尸<0．01，P<0．01)；非肥胖PCOS组血清瘦素水平明显高于非肥胖对照组(尸0．05)。偏相关分析显示PCOS患者血清瘦素水平与BMI和HOMA-IR均呈高度正相关(P0．05)。

7、2、(1)PCOS和正常组卵泡液瘦素与睾酮呈正相关(r=O．444，P<0．01)：(2)PCOS组卵泡液瘦素水平明显高于对照组(

8、P

9、，但对P的分泌无影响。4、(1)颗粒细胞JAK2和STAT3蛋白质酪氨酸磷酸化分析表明，PCOS患者酪氨酸磷酸化程度与正常对照组相比均显著下降(尸<0．05)。(2)颗粒细胞JAK2激酶的活性分析表明，PCOS患者JAK2的活性比正常对照组下降35．53％，差异具有极显著性意义(P<0．01)。5、24例研究对象发现外显子4上有位置异常的电泳条带，经直接测序分析，为A670—G670的纯合多态性突变