ATSN模型大鼠肾组织差异表达基因的筛查及PDTC的防治研究

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1、南京医科大学硕士学位论文ATSN模型大鼠肾组织差异表达基因的筛查及PDTC的防治研究中文摘要目的：(1)复制大鼠系膜增生性肾炎，即抗胸腺细胞血清性’净炎(anti—thymocyteseruminducednephritis，ATSN)模型观察其不同阶段的病理变化，研究ATSN病变演变规律。(2)筛选ATSN大鼠发病凋亡和增生时相肾组织差异表达基因的变化并定量检查凋亡相关基因NGFI．B(nervegrowthfactorinducedproteinI-B)和Gadd45TfgrowtharrestandDNA

2、damage45gamma)mRNA的表达水平，从基因层面上探讨ATSN大鼠肾小球系膜细胞(mesangialcell，MC)凋亡的可能原因。(3)研究ATSN大鼠不同病程中’肾小球内核转录因子．vd3(nuclearfactor-vd3，NF—KB)的表达及其NF一1(B抑制剂一吡咯二硫氨基甲酸脂(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)对大鼠病变的影响。方法：(1)制备兔抗大鼠胸腺细胞抗血清(anti—thymocyteserum，ATS)复制ATSN动物模型，取发病40min，24

3、h和7d的肾皮质标本进行光镜、电镜、免疫荧光和免疫组化及末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Tdt-mediatedX-dUTPnickendlabeling，Tunel)技术检查大鼠肾小球MC凋亡、坏死和继发增生的病理改变。(2)利用基因芯片杂交筛选ATSN大鼠发病40min，5d时肾组织差异表达基因谱的变化，并登陆Genebank查找已知的基因功能，选择两个表达上调且与凋亡相关的NGFI—B和Gadd45T基因，应用RT-PCR和real．timePCR分析定量NGFI．B和Gadd45T．基NmRNA的

4、表达水平。(3)复制大鼠ATSN模型，应用PDTC处理，将实验分为三组，即ATSN模型组、ATSN+PDTC南京医科大学硕士学位论文处理组和正常对照组，取上述三组大鼠实验40rain，24h和7d的肾皮质标本，除了用免疫组化方法检查NF．v．Bp65表达外，还应用光镜、电镜及Tunel技术观察PDTC对ATSN大鼠各期病变的影响，判断PDTC的抑制效应。结果：(1)ATSN大鼠光镜下可见肾小球MC先溶解坏死，数量下降；病程7d时，’肾小球细胞数显著增多；早期肾小球内有明显的兔IgG和C3沉积；实验24h后，增殖

5、抗原PCNA和13．一SMA均有表达。电镜下，实验40rain，肾小球MC呈现凋亡改变，24h时MC已有溶解，7d时MC明显增生，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)也显著积聚。Tunel检查证实，实验40min，凋亡细胞阳性着色较多，随着病程的进展，阳性细胞逐渐减少。上述结果提示：ATSN病变确实存在凋亡、坏死和增生三个阶段，这与国外学者Shimizu报道基本相符。(2)基因芯片在9234个大鼠基因中筛选出40min时，ATSN大鼠’净组织上调基因为341个，其中部分与凋亡有关，部分与

6、增生相关，部分与信号转导相关。下调基因为392个，其中部分是一些酶类基因，部分为细胞因子受体基因。实验5d时，肾组织上调基因213个，下调基因119个，部分与细胞增生相关，两阶段大多上调基因和下调基因功能不详。(3)应用RT-PCR和real．timePCR检查含NGFI．B和Gadd457，结果显示，实_拟0rain，NGFI．B和Gadd45ymRNA表达均显著高于对照组，且实验40min，NGFI-BmRNA水平较5d时明显增多。与芯片杂交信号强度的ratio值趋势一致。(4)检查ATSN大鼠不同时期NF

7、一证；p65的表达，24h明显增多，7d时达到较高水平。而用PDTC处理的ATSN大鼠，实南京医科大学硕士学位论文验第7d，不仅NF．rd3p65表达显著低于ATSN模型组，而且此时肾小球MC增生数及ECM的分泌量亦较ATSN模型组明显减少(但PDTC对ATSN大鼠凋亡和坏死性病变影响并不显著)。结论：(1)ATSN大鼠肾组织病变确实存在凋亡、坏死和继发增生三个时相。(2)ATSN发病与众多基因异常表达有关，其中NGFI—B和Gadd45y基N表达上调可能与肾小球MC的早期凋亡存在一定的联系。(3)ATSN大鼠

8、病变过程中有NF-KB信号分子的活化，尤以MC坏死和增生阶段较为明显。PDTC不仅能减少NF．1cB的表达，而且主要对ATSN大鼠的继发增生病变有显著的抑制效应。关键词：系膜增生性肾炎(或抗胸腺细胞血清性肾炎)；NGFI．B；Gadd45一／；肾小球系膜细胞(MC)；凋亡；增生；NV．-KB；PDTC南京医科大学硕士学位论文Thedetectionofdifferentgenesexp