《应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：杨廷易矽Jf年胁月B日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密吣／(请在以上方框内打“√”)学位论文作者(需亲笔)签名：夼勿复易枷J『年修月B日导师(需亲笔)签名：加，7年／2月乃日 目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．III缩略词表(Abbreviation)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．V第一部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11兔出血症⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1兔出血症的流行病学、临床症状及病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2病原分子生物学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3疫苗的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．62噬菌体展示及随机肽库技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．1噬菌体展示技术的原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2噬菌体展示系统分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．3噬菌体随机肽库⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一112．4噬菌体展示技术的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第二部分实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。23第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯251．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。251．1．1生物材料及试剂盒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯251．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．1．4实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。261．2．1兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．2．2噬菌体展示肽库的亲和筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．1兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．1．1单抗A3c的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．1．2单抗A3C亚型的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342。1．3纯化后单抗A3C的纯度的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．1．4纯化后单抗A3C浓度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．352．1．5单抗A3C效价的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．352．1．6单抗A3C亲和常数的测定。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．352．2噬菌体展示肽库的亲和筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．362．2．1亲和筛选结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．2．2三轮洗脱液中噬菌体与靶分子单抗A3c亲和活力⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．2．3噬菌体单克隆ELISA鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．372．2．4噬菌体单链DNA序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．2．5噬菌体克隆的特异性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40 应用噬菌体展示技术筛选兔出J矗L症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法⋯⋯⋯⋯⋯451材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯471．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。471．1．1试剂和血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯471．1．2仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯471．2方：法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。471．2．1应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．471．2．2间接ELISA最佳反应条件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．481．2．3间接ELISA操作程序的确定和结果判定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．491．2．4阻断试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯491．2．5敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯501．2．6保存期试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯501．2．7重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯501．2．8临床应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯502结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯502．1应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．2间接ELISA最佳反应条件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．512．3间接ELISA操作程序的确定和结果判定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯552．4阻断试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．562．5敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．562．6保存期试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．562．7重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．572．8临床应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．573讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6l附录：主要试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65 摘要应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立兔出血症(RabbUHemorrhagicDisease，Rim)是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdisease1，护淞，RI-mv)弓l起的家兔的一种高度接触性、致死性传染病，以肝细胞坏死、实质脏器出现淤血及出血性变化、死亡率高等为特点，给养兔业造成巨大的经济损失。噬茵体展示技术通过模拟配体．受体间的特异性结合作用而达到从噬茵体多肽文库中筛选特异性配体的目的。该技术被广泛应用在抗原表位筛选、疾病检测、疫苗研究以及多肽药物筛选等方面。在抗原表位的研究中，主要使用亲和筛选的方法，通过三到四轮亲和筛选，有效富集特异性噬菌体克隆，获得抗原模拟表位。本研究为获得抗原RHDV的抗原表位，使用实验室构建的抗RHDV单抗A3c作为固相筛选分子，用噬菌体展示技术进行亲和筛选。为获得新型RHDV检测方法，在亲和筛选的基础上，用筛选得到的噬茵体克隆作为模拟抗原，建立了检测兔血清中RHDV抗体的间接ELISA方法。抗原表位的研究为RI-IDV分子生物学的进一步研究和新型疫苗的探索提供基础，而间接ELISA方法的建立为兔场免疫效果的评价和流行病学调查提供了有利工具。具体试验内容和结果如下：1．RHDV抗原模拟表位的筛选。复苏实验室保存的RHDV单抗A3c杂交瘤细胞系，并制备腹水型单抗。单抗纯化后测定其纯度、浓度、效价及亲和常数。用高活性、高纯度的单抗作为固相筛选分子，应用噬菌体展示技术进行亲和筛选，对筛选的噬菌体克隆进行鉴定并测序，获得与抗原高度同源的序列，即抗原的表位。结果表明，制备的单抗经纯化后纯度高于80％，ELISA效价为l：81920，亲和常数为3．5x101，具有较高的纯度和活性，可以用作固相亲和筛选。经过三轮亲和筛选，有效富集了特异性噬菌体克隆。用夹心ELISA方法鉴定，结果表明25个噬茵体克隆中19个为阳性克隆。竞争ELISA方法进一步验证了这些克隆与单抗的结合具有特异性。接下来对阳性噬茵体克隆进行测序，结果表明，获得了与抗原高度同源的序列GTDDMDPGT"A，即抗原的模拟表位。其中，氨基酸基序DXXDP为表位中的核心氨基酸。2．应用亲和筛选得到的阳性噬菌体克隆K1作为模拟抗原，建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法。本研究对ELISA的各个反应条件进行优化，测定该方法的特异性、灵敏性、重复性以及包被的酶标板的保存期，并用该方法检测了100份兔 应用噬菌体展示技术筛选兔出J血L症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立血清中抗体水平。实验结果表明，该方法中噬茵体的最佳包被浓度为1．56x107pfu／ml，血清的最佳稀释度为1：200，5％BSA为最适封闭液，酶标二抗的最佳稀释度为l：5000，封闭液的封闭时间、抗原抗体作用时间、酶标二抗作用时间以及底物的显色时间分别为90rain、30min、30min和10min。应用该方法检测100份兔血清中的RHDV抗体水平，其中阳性样品数为86(86％)，而用实验室建立的RHDVVP60蛋白间接ELISA方法检测，阳性样品数为73(73％)。比较两种检测方法，符合率为85％。因此，该ELISA方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简便，适用于临床推广。关键字：兔出血症病毒；单克隆抗体；噬茵体展示技术；模拟表位；间接ELSIAII SCREENINGOFANTIGENMIMoTOPESoFR4艿8乃’磁彻屁尼删G!圮砒删胚啪嬲BYPHAGEDISPLAYTECHNOLOGYANDDEVELOPMENTOFELISAFORDETECTIONoFANTIBODIESAGAINSTTHISVIRUSABSTRACTRabbithemorrhagicdisease(miD)isahighlycontagiousandfataldiseasebyRabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV)．Itisassociated谢tIlnecrosisinhepaticcells，congestionandbleedinginparenchymatousorgansandhi曲mortality,whichcausedseriouseconomicallossesinrabbitry．ThephagedisplaytechnologyisatechnologyforscreeningspecificligandfromphagedisplayrandompeptidelibrarythoughtheSpecificbingdingbetweenligandandacceptor．Itiswidelyusedtoselectantigenepitopes，detectdiseases，studyvaccinesandselectpolypeptidedrugs．Thebiopanningismainlyusedintheresearchofselectingantigenepitopes．Thespecificphageclonesareenrichedeffectivelyafterthreetofourroundsofbiopanning，andantigenepitopesaregot．InordertogettheepitopeofRHDV,theMcAbA3cagainstRHDVdevelopedbythelaboratoryhadbeenusedassolid-phaseselectivemoleculetoscreenbyphagedisplaytechnology．InordertogetanewmethodtodetectRHDV,theindirectELISAtodetecttheantibodiesagainstRHDVhadbeendevelopedwithphageclonegotfrombiopanningatthebasisofresultofbiopanning．111estudyofantigenepitopewillprovidetheoreticalbasisforstudyingthemolecularbiologyofRHDVandnewvaccines．ThedevelopmentofindirectELISAwillsupplyafavorabletooltoevaluateimmunityeffectinrabbitryandsurveyepidemiology．Thedetailsofcontentandresultwereasfollowing：1．ScreeningofantigenmimotopesofRHDV．McAbA3chybridomacellstrainagainstRHDVinthelaboratoryWasrecoveredandtheascitesantibodywasprepared．Thepurity,concentration，titerandtheaffinityconstantoftheantibodyweredeterminedafterpurifying．Usinghi曲lypureandactiveMcAbassolid-phaseselectivemolecule，thebiopanninghadbeendonebyphagedisplaytechnology．Thephageclonesselectedweredeterminedandsequencedtogethighlyhomogenoussequencecomparingtoantigen，whichistheantigenepitope．TheresultsshowedthatthepurityofMcAbA3cWasmorethan80％，theELISAIII 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立titerwas1：81920andtheat砌tyconstantwas3．5×107加purifying．ThepurifiedMcAbcanbeusedassolid-pbaseselectivemolecule．Afterthreeroundsofbiopanning，thespecificphageswereenrichedeffectively．ThesandwichELISAshowedthat19outof25phagecloneswerepositiveandthecompetitiveELISAfurthersuggestedthatthepositivephageclonescaIlspecificallybindtothemonoclonalantibody．Thesequenceanalysisofthepositiveclonesshowedthathighlyhomogenoussequence(GTDDMDPGTTAA)comparingtoantigenWasgot，whichistheantigenmimotopesofRHDV．ThesequenceDXXDPWasthecoreaminoacidsinepitope．2．Theindirectenzyme-linkedimmunosorbentassay(iELISA)methodWasdevelopedtodetectrabbitantibodyagainstRHDV,usingthephagecloneKIgotfrombiopanningasantigen．ThereactionconditionsofELISAwereoptimized；thespecificity,sensitivity,repetitivenessandretentionperiodofELISAplatecoatedweredetected；and100serumsofrabbitweredetectedbythemethod．Theresultshowedthatthebestconcentrationofphagewas1．56x107pfu／mlandthedilutionoftheserumsamplewas1：200；5％BSAwasthebestconfiningliquid；thedilutionofHRP··goatanti·-rabbitIgGwas1：5000；thereactiontimeofcon_finingliquid，antigenandantibody,HRP-goatanti-rabbitIgGandsubstratewere90min，30min．30minand10minseparately．AntibodiesagainstRHDVin100serumsofrabbitweredetectedbythemethodandthepositivesampleswere86(86％)，whichwere73(73％)bythemethodofRHDVVP60．indirectELISAdevelopedbythelaboratory．TheconcordantratebetweenthetwomethodsWas85％．Thus。indirectELISAdevelopedinthestudyWasspecific，sensitive，reproducibleandeasilyoperateindetection，whichindicatedthatthismethodWasappropriateforapplicationinclinicaldiagnose．KEYWORDS：Rabbithemorrhagicdiseasevirus；Monoclonalantibody；phagedisplaytechnology；mimotopes；indirectELISA．IV 缩略词表缩略词表(Abbreviation)RHDVPmpHSDSPAGEOIEELISAORFH／hKbN队TSATMcAbPEGDMSO斗LmLnUndMrpm彳／ODNCIgGKDBSAbpAg“gpLmgRabbithemorrhagicdiseasevirusPhageformingunitPowerofhydrogenSodiumdodecylsulphatePolyacrylamidegelelectrophoresisWbddOrganizationforAnimalHealthEnzyme-linkedImmunosorbentAssayOpenreadingframeHourKilo-basepairMicroagglutinationtestSlideagglutinationtestMonoclonalantibodyPolyethyleneglycolDimethylsulphoxideMicroliterMilliliterMinuteDayMol／LRevolutionsperminuteOpticaldensityNitrocelluloseImmunoglobulinGKilodaltonBovineserumalbiumBasePairAntigenMicrogramMicroliterMilligram兔出血症病毒噬菌斑形成单位酸碱度十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳世界动物卫生组织酶联免疫吸附试验开放阅读框小时千个碱基对微量凝集试验玻片凝集试验单克隆抗体聚乙二醇二甲基亚砜微升毫升分钟天摩尔研转／分光密度硝化纤维免疫球蛋白G千道尔顿牛血清白蛋白碱基对抗原微克微升毫克V 文献综述第一部分文献综述l兔出血症1．1兔出血症的流行病学、l隘床症状及病理变化兔出血症(RabbitHemorrhagicDisease，RHD)俗称兔瘟，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种高度接触传染性、急性、致死性传染病，以传染性极强、呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征【l】，流行特点是潜伏期短，发病快，死亡率高，流行范围广12j。1984年，该病首次在中国江苏进行报道，随后的几个月内，该病遍及国内的所有商业兔场，同时，该病也首次入侵韩[]t31。1986年，该病进入意大利【41，并导致成千上万的家兔死亡，并因不知其病原被一度称为‘‘X病”，随后该病在欧洲其它国家逐渐出现。到了1988年的6月和7月，西班牙出现该病，不久之后，捷克【51、法国【6】、前苏联、非洲的部分地区、古巴、墨西哥【7】、印度也陆续报道。由于兔的急剧减少而引起濒危动物的食物来源危机，随着该病1990年到达斯堪的纳维亚以及1994年到达英国，该病正式被西方国家列入防治重点。目前RHD在世界各个地区均有流行，并对世界和中国的养兔业造成巨大的经济损失，而且严重威胁濒临灭绝的野兔品种。因此，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为“国际动物保健编目”B类疫病，我国将其列为二类疫病。本病多在冬春寒冷季节流行，夏秋炎热季节则很少发生。3月龄以上的兔的发病率为95％．100％，2．3月龄发病率和死亡率均为80％左右。1．2月龄家兔的发病率和死亡率为50％，1月龄以内的幼兔很少发病。以纯种西德长毛兔最易感，其他品种的易感性也较强，在性别上无显著差异【引，其他动物，如牛、猪、羊、狗、鸽、鸭、鸡、鹅、鸟、鱼、及各系大、小鼠均无易感性【91。本病主要通过被分泌物、排泄物污染的饲料、饮水、用具以及人员来往问接传播【lo】，也可经直接接触传播，经口腔、皮肤划痕、眼结膜、滴鼻、腹腔等途径人工感染均可复制本病。本病潜伏期短，一般在30．48小时内发病死亡，根据临床特征可将患兔分为最急性、急性和慢性型。(1)最急性型：多见于非疫区或流行初期。无任何前兆或仅表现短暂兴奋，而后卧地挣扎，尖叫而死。(2)急性型：病兔食欲降低，精神沉郁，被毛光泽减退，体温升高1-2"C，有的高达41℃以上⋯J，有渴感，眼结膜初期为潮红色，后变为暗紫色。耳壳潮红，湿热。 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELlSA抗体检测方法的建立多数病兔呼吸急促，部分出现腹胀，多便秘，粪便干硬且带灰白色或淡黄色粘液，甚至血丝。少数病兔尿带红色。病程1．2天，临死前表现为短时间内突然兴奋、挣扎、倒地，四肢作急速的前后划动，高声尖叫，抽搐死亡。死后呈角弓反张。临死前肛门松弛，其周围被粪便污染，含灰白色粘液【121，体温可降至正常水平，甚至更低【131，有的鼻孔流出泡沫状粘液【141。(3)慢性型：多见于老疫区或流行末期，潜伏期和病程长，精神不振，采食减少，迅速消瘦，衰弱而死。有的可以耐过，但生长缓慢，发育较差【15】。自然病例和实验感染病例的病理变化基本相同，病死兔的营养状况多数良好，可视粘膜发疮，呈全身性败血症【161。气管、喉头弥漫性充血、出血，呈“红气管”现象，气管内充盈大量血染泡沫。肺水肿，肺叶上有大量出血点，甚至出血斑。心包积液，心包膜点状出血。肝脏肿大，呈土黄色或淡黄色，质脆，肝小叶间质增宽，有的肝表面有灰白色散在坏死小点。肾脏淤血，肿大，呈暗紫色。脾脏肿大。胃内容物充盈，胃粘膜易脱落【14】。十二指肠、回肠充血，有时可见出血小点。性腺、输卵管和脑膜亦可见充血和出血。组织学变化以全身实质器官特别是肾、脾、肺充血、出血、血栓、微血栓形成为特征。肝、肾实质细胞出现变性和广泛性坏死，脾脏充血、出血，淋巴组织萎缩和淋巴细胞排空。在电镜下，最常见的是线粒体肿胀变化、空泡化，毛细血管管壁断裂、消失。1．2病原分子生物学兔出血症的抗原为兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)。从形态学、生物化学和分子生物学对该病毒形态、基因组结构与功能的认识，1995年国际病毒分类委员会(ICm在第6次分类报告中正式确立了RHDV在病毒学中的分类地位，将其归类于嵌杯病毒科(C口，耙fv驴矗勋P)【17-191，ICTV于2000年最新的报告中将RHDV列入新成立的杯状病毒科兔病毒属。1．2．1RHDV形态结构RHDV为圆形，正二十面体立体对称，没有包膜，外径为25am．50am，一般为32am．34rim。芯髓直径约20am，由60kD的多聚蛋白VP60组成衣壳，核衣壳厚4am．6am，表面有直径4am的壳粒32．42个，分子量2．38．2．58x106ku。1．2．2RHDV基因组结构及其功能1991年MeseguerM等克隆并测定了RHDV基因组的全序列ROl，这是首次报道的杯状病毒的全序列。此后，KonigM等【21J将RHDV感染了原代兔肝培养细胞，并在此基础上进一步研究了病毒基因组结构。2 文献综述(1)RHDV基因组RHDV基因组为单股正链RNA，全7437bp，分子质量为2．4×103ku"-'2．6x103ku，5’末端无帽状结构，而是与感染性有关的Vpg(Virionproteingenomelinked，Vpg)共价结合，3’末端具有一个短的poly(A)j匡122]。基因组的lbp～9bp为5’非编码区，最后59bp为3’非编码区。该病毒的RNA基因仅含两个开放阅读框(openreadingframe，ORr)口引，ORFl的长度约占整个基因组全长的94％，位于5’端，从10bp延伸至7041bp，编码一个含有2344个氨基酸残基的多聚蛋8(257ku)。该多聚蛋白在蛋白酶解过程中被病毒编码的蛋白酶(胰蛋白酶样半胱氨酸，trypsin．1ikecysteineprote2ase)进一步酶解加工释放，通过体外表达系统发现可产生相对分子质量分别为80、73、60ku和43l(u的4个主要多肽，这4个多肽分别相应于病毒多聚蛋白的2C解旋酶(80ku)、一个保守区(43ku)、3C样蛋白酶和3D样聚合酶(73ku)以及衣壳蛋8(60ku)，其中2C解旋酶是一种与RNA复制有关的螺旋酶，3C样蛋白酶具有半胱胺酸蛋白酶活性，与病毒蛋白的翻译后加工有关，3D样蛋白酶是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RaRp)，病毒衣壳蛋8(60ku)为病毒的结构蛋白，称为VP60。利用体外转录翻译系统对RHDV的基因组图谱进行了更为详细的定位【24】，RHDV的ORFl在该系统中可产生7种非结构蛋白和1种病毒的结构衣壳蛋白，用大肠埃希菌表达覆盖整个RHDV多聚蛋白内不同区域的基因，并以这些表达产物制备了一系列的抗血清来识别多聚蛋白的酶解产物，利用放射性免疫技术对Vpg进行定位后发现，RHDV的ORFl基因序列为NH22．P16一P23．P37(HEL)．P30．P14(Vpg)一P70(Pro．P01)．VP60．C00H。RHDV基因组3’末端的短开放阅读框(ORV2)位于7025bp．7378bp之间，与ORFl的3’末端约有19个核苷酸重叠，长度约为353bp，编码一个由177个氨基酸残基组成的分子质量为12ku的蛋白(VPl0)，该蛋白与VP60相比含量较低，是一个碱性蛋白。(2)RHDV亚基因组RHDV除基因组RNA外，在感染的组织和病毒颗粒中还含有2．4kb的亚基因组RNAt2蜘，对亚基因组RNA序列分析表明，该亚基因组5’端与基因组5’端类似，保守序列中含有16个核苷酸，与基因组仅有2个核苷酸差异，且在5’末端也与VPg蛋白共价结合，据推测该序列可能在病毒的包装、复制或转录方面提供信号作用，同时R／4_DV亚基因组与全基因组的3’端从第5296个核苷酸处开始与其对应的序列一致，在全基因组中该对应序列为编码VP60的部位。1991年Meyers等利用蔗糖密度梯度离心、Northern杂交及病毒抗原试验等方法阐述了RHDV亚基因组RNA壳体化现象，并且发现RHDV基因组与亚基因组RNA可分别包装进病毒衣壳内。郑东等t26】利用低 应用噬菌体展示技术筛选兔出m症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立温电子显微技术(electroncryomicroscopy，cryo．EM)和计算机像重构技术(imagereconstructiontechniques)钡lJ定了野生型RHDV的三维结构，为RHDV亚基因组RNA壳体化提供了证据。现已有研究小组发现，在体内VP60既可由亚基因组翻译而来，也可通过先合成一个大的多聚蛋白，然后再经蛋白酶裂解而来。1．2．3RHDV的结构蛋白与非结构蛋白1．2．3．1结构蛋白(1)VP60。RHDV粒子衣壳由180个化学上完全相同的亚单位组成，单体的分子质量约为60ku，故称为VP60，是RHDV的主要结构蛋白，它在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。根据NeilJD【27】研究，嵌杯样病毒衣壳蛋白的氨基酸序列分为i(1---,21)，B(22,---300)，C(301"-'328)，D(329--一343)，E(344--一434)和F(435"--580)6个区，通过对嵌杯样病毒的两个成员圳(Norwalkvirus)和RHDV的电镜观察发现【2睨9】，其结构蛋白折叠成两个主要的紧凑区域，并由一个第3区域作为铰链区将二者连接在一起。TorrecuadradanMJL等【30J对VP60的抗原结构进行了详细研究，发现了病毒衣壳上的两个主要抗原区域，分别位于VP60蛋白N端的第3l位到第250位氨基酸之间和C端的第477位到第579位氨基酸之间，但最主要的抗原区可能位于VP60蛋白N端．jViaplanaE等【3l】也从另一角度证实了此结论的正确性，他们将RHDV的衣壳蛋白VP60分成5个相互重叠的片段，分别在大肠埃希菌中进行表达，应用蛋白质免疫印迹技术与自然感染和人工免疫兔的RHDV抗血清进行反应，结果显示VP60蛋白氨基端(包括蛋白的前175个氨基酸)与抗血清的反应最强，而蛋白羧基端则较弱。因此，研究者们推测病毒VP60蛋白羧基端的抗原结构主要是依赖于构象决定簇的B细胞位点，而蛋白的氨基端则是线形的抗原决定簇，其在病毒感染和灭活疫苗的免疫中诱导机体产生免疫应答。法国学者La_uremS等详细研究了RHDV衣壳蛋白折叠的机理，并对衣壳蛋白上抗原的结构和分布进行了研究。进一步证实VP60由两个同心圆构成，病毒VP60蛋白的C末端组成了病毒的外表面(P区，即Producting区)，而N末端构成了衣壳的内壳。BarcenaJ等132J研究者发现VP60三维构象的形成与各个亚基的N末端序列有关，如果将该区段的序列缺失后，VP60不能装配成空衣壳。由于RHDV至今未找到合适的稳定的传代细胞，现行的疫苗只能用自然或人工感染RHDV致死的兔肝脾组织制备组织灭活疫苗或加了白油佐剂的油乳剂灭活疫苗，存在诸多弊端。因此，近年来国内外研究学者为研制新型疫苗-RHDV亚单位疫苗，对RHDVVP60的基因表达进行了大量的研究，并取得了一定的研究成果。BojaJA等【33J4 文献综述将RHDV的VP60基因在大肠埃希菌中进行表达，但重组VP60只有自然VP60的部分抗原性，不能诱导机体产生保护性免疫应答；而在T7RNA聚合酶表达系统中表达的VP60，其免疫原性与病毒多肽相似，可使免疫兔获得保护。随后，又有多个实验室分别在杆状病毒、昆虫细胞、酵母【341、转基因马铃薯【35】、痘病毒表达系统中成功表达了可自发聚合成病毒样颗粒(VLPs)的RHDV的衣壳蛋白，且该病毒颗粒在物理形态和免疫原性上与完整的自然野毒株无任何差别，但VLPs不包含病毒RNA，不具备感染性，用其免疫兔可获得对野毒株RHDV攻击的保护。为制备RHDV基因工程疫苗，研制诊断试剂，研究病毒子的形成和病毒与细胞受体的相互关系提供了较好的材料。西班牙学者BarcenaJ等136】以天然弱毒株MV6918株构建了表达RHDVVP60蛋自的重组病毒，经皮下和口服免疫兔后，该重组病毒可以同时保护兔抵抗RHDV和MV的强毒攻击，这一研究为研制高效、低成本，又可同时有效预防家兔、野兔感染RHDV和MV的新型疫苗奠定了基础。鉴于RHDV的宿主范围比较严格，只感染兔，RHDVVP60可以在没有其他任何成分存在的条件下，仅有VP60蛋白即可在体外自聚成VLPs，而且VP60的N端42个氨基酸缺失也不会影响其包装功能，因此可考虑将RHDV作为基因转移载体来表达外源基因。MehdaouiS等【37】将人乳头状瘤病毒(HPV)的L1蛋白融合于VP60的N端，结果重组的VP60可在昆虫细胞中表达并装配成VLPs，其大小与自然RHDV的VLPs很相似。(2)VPl0。VPl0由RHDV的ORF2编码，其含量很低。研究发现ORF2的起始密码子(AUG)位于ORFl终止密码子的前3．5个核苷酸。将ORFl的大部分碱基缺失或替换后对ORF2的表达没有明显影响，但ORFl3’端的84个核苷酸对VPl0的表达却很关键，VPl0即使在没有起始密码子(AUG)存在的情况下也可表达，故推测ORF2的翻译可能并不依赖于起始密码子(AUG)的存在，而是要求起始位点上游某序列元件必须存在【3羽。有关RHDVVPl0的一些生物学特性目前还不清楚，有试验表明VPl0与病毒衣壳的形成无关，但却是成熟病毒粒子中的一个小结构蛋白，它可能在病毒子中与病毒RNA结合，在基因组RNA的包装中发挥一定作用。1．2．3．2非结构蛋白由ORFl编码的多聚蛋白前体经裂解可产生的几种蛋白中，除VP60和VPl0外，其他均为非结构蛋白，在RHDV的非结构蛋白序列中，按顺序性排列着2C解旋酶、3C解旋酶和3D多聚酶，这与小RNA病毒十分相似，而其中的RNA螺旋酶(HEL)、蛋白酶(PR0)以及RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)这3种酶在多聚蛋白前体中的排列次序与Picomavims．1ike超家族中的正链RNA病毒成员相同。此外，RHDV非结构蛋白p16、p23和p3在多聚蛋白前体中的排列位置分别对应于属于小RNA病毒中的脊 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立髓灰质炎病毒(Poliovirus)的2A、2B和3A蛋白，但它们之间无明显的序列相似性。RHDV的非结构蛋白序列中，对2C．1ike蛋白酶、3C．1ike蛋白酶、Vpg和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的研究相对比较深入，3C2．1ike蛋白酶又是其中研究比较早也较详细的蛋f3t39]。如前所述，ORFl编码一个分子质量约为257ku的多聚蛋白体，该多聚蛋白前体在随后的蛋白酶加工过程中裂解为各个成熟的蛋白，而研究发现执行这一裂解功能的蛋白酶便是3C2．1ike蛋白酶，它与小RNA病毒中的3C2．1ike蛋白酶很相似，也是由病毒基因组自身编码的，可以特异性切割多聚蛋白前体。在多聚蛋白前体中已经鉴定出至少有7个3C2．1ike蛋白酶的特异性裂解位点【4叫¨，意味着经3C2．1ike蛋白酶裂解的多聚蛋白前体至少可产生8个功能蛋白。对RHDV3C2．1ike蛋白酶的研究还发现，3C2．1ike蛋白酶除具有即可反式又可能顺式裂解多聚蛋白前体的功能外，还可能参与抑制宿主细胞蛋白的翻译过程。MitraT等D2]发现重组的泛西洛韦(famciclover，FCV)3C2．1ike蛋白酶可以在没有其他病毒蛋白存在的情况下，裂解宿主细胞的poly(A)结合蛋I刍(PABP)，研究结果证实了3C2．1ike蛋白酶在宿主细胞蛋白的翻译过程中起一定的作用。1．3疫苗的研究现状由于至今RHDV于体外无法适应任何细胞培养，现行疫苗只能用自然或人工感染RHDV致死的兔肝脾组织制备组织灭活疫苗，抗原制备麻烦，纯化过程繁琐，且抗原特质难免会发生一些变化。因此，新型疫苗的研制势必成为研究的重大趋势。由于VP60在诱导宿主免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原，且编码基因高度保守，可用于制备RHD亚单位疫苗。另外，很多学者将更多的精力放到了多联苗的研究，该研究对于兔场的多种疾病的防控具有重要意义。1．3．1佐剂灭活疫苗的研究兔出血症病毒自1984年发现以来，其脏器甲醛灭活疫苗便可以提供坚强的免疫力，疫区紧急预防后3d，发病率便直线下降【431。目前使用的组织灭活疫苗均取自于感染病死兔肝脏，通过将它用O．4％甲醛灭活，并加入适量防腐剂和缓冲试剂，37℃灭活作用适当时间，便可制得疫苗。一般兔瘟病首免在40．45日龄进行，用量2IIll，60一65日龄二免，用量lml；以后每半年1次。常规灭活疫苗在免疫接种后4h可以检测出干扰素，效价为9000U／mlm】，同时可以检测出IL．121451。6。8d产生保护性抗体，16．18dHI滴度达到2¨之上，以后缓慢下降。为了增加灭活疫苗的应用价值以及使用效果。我国科研工作者在佐剂疫苗做出了大量的研究。安徽农业大学使用铝胶作为佐剂制备的疫苗产生的抗体峰值、免疫期均 文献综述高于常规疫苗。其他研究者的研究也验证了铝胶佐剂的效果。而油佐剂的研究表明，免疫油佐剂后抗体上升缓慢，但持续的时间长，并且保质期要优于常规疫苗。蜂胶佐剂对于兔瘟常规疫苗的免疫效果也具有较好的作用。另外，有的工作者使用其他物质作为佐剂来研究兔瘟疫苗的效果。比如使用中药淫羊藿、黄芪、人参作为佐剂。还有一些学者将囊素作为佐剂进行试验后，发现它可以加快抗体产生速度，提高抗体水平，延长抗体时间。另外也有研究者将长白山黑蚂蚁、地衣芽孢作为佐剂引入，结果显示，它们可以促进T细胞活性，加强细胞免疫功能。1．3．2基因工程苗分子生物学的发展为病原微生物的研究提供了新技术，许多具有病原功能的蛋白经证实具有较好的免疫原性，有关兔出血症病毒功能蛋白的表达也有了相当深入的研究。1994年西班牙学者Boga等【46】在大肠杆菌中以T7RNA聚合酶为基础研究表达了与天然VP60抗原性极为相似的蛋白质，可诱导产生有效的保护性免疫。但是由于原核载体表达蛋白不可溶性，所以应用前景有限。为此，Laurent等【47】先后改用杆状病毒．昆虫细胞系统表达了VP60，ELISA和Western-blot分析证实了表达产物的抗原性，免疫家兔5d后有强烈的体液免疫反应，15d后可抵抗RHDV攻击。SoledadMatin等也用此系统表达了VP60蛋白，使用重组杆状病毒裂解物作为抗原，免疫后的24d，可激发保护性免疫反应。PlanaDuran等将VP60于杆状病毒的多角体蛋白和PIO控制下，在昆虫细胞进行表达VP60，O．5岭剂量即可诱导针对RHD的免疫。1994年法国学者SylvieLaurent等也在杆状病毒系统中表达了RHDV的VP60基因，重组VP60可装配成病毒样颗粒VLPs。1995年澳大利亚学者Nagesha也用杆状病毒系统表达VP60，ELISA和Western—blot证实了其免疫原性。酵母系统具有高效、经济表达的外源蛋白特性，Boga等又在表达载体PMA91中表达酵母甘油激酶的调控区，插入编码VP60的序列，然后应用重组载体PMAVP60转化酵母株DBY-476系统表达RHDV衣壳蛋白，电镜观察表明抗原与天然病毒均有相似的VLPs。Castanon等【481将RHDVAST／89株VP60基因克隆到植物表达载体PK2，构建了表达载体PK2．VP60和双重载体PROK3，重组载体转化马铃薯叶片外植体，转基因马铃薯表达的蛋白与天然VP60相似，分子量约为6万，免疫试验证明表达物质具有良好的免疫保护效果。Fernandez等构建了一个以马铃薯病毒(PPV)为基础的外源蛋白表达载体，重组病毒PPV-NK-VP6感染植物N．clevedanii后15d可用Westem-blot检出VP60。除传统的大肠杆菌、酵母和昆虫细胞表达系统表达的亚单位疫苗外，出现了利 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立用转基因植物作生物反应上的生产VP60疫苗的新途径，但VP60的在植物细胞中的最终表达量很少，所以未来的研究重点是如何提高疫苗蛋白在植物中的表达量。Bertagnoli等149]为预防家兔和野兔RHD，用牛痘歌本哈根株构建了1株重组牛痘．RHDV病毒，即应用黏液病毒SG33株，表达约6万左右的RHDV衣壳蛋白VP60，可在免疫沉淀、间接荧光试验中与RHDV抗体反应。LaurentFischer等以ALNAC为基础，构建了1株表达RHDVVP60蛋白的重组病毒(vCP309)，免疫后，机体表现出较高的抗体水平。目前，专家正在对作为兔免疫接种新载体的高度致弱牛痘株(如NWAC)或其他痘病毒(鸟痘病毒、兔痘病毒)的潜力作进一步研究。JuanBareena等用MV的1株自然弱毒株(MV6918)构建了重组RHDV活载体疫苗(6918VP60．T2)，MV经吸血昆虫(蚊、跳蚤)等传播，通过吸血昆虫携带重组病毒，可以大大增加兔群中免疫兔的比例。1．3．3多联苗的研究(1)兔瘟、巴氏杆菌二联茁。兔瘟、兔巴氏杆菌病是传染快、流行广、发病急、死亡高、危害性大的家兔毁灭性传染病。为控制该病的发生和流行，降低家兔发病死亡，保护养兔业的健康发展，四川省井研县自1991年以来，应用自己研制的兔瘟、巴氏杆菌二联苗对该县家兔进行免疫试验，在全县开展田间试验，取得了显著的经济、社会效益。实践证明该疫苗不论是预防免疫，还是紧急免疫，都对兔瘟和巴氏杆菌病有较好的免疫效果。二联苗紧急接种对健康兔或初发病的兔免疫效果较好，能获得坚强免疫力；而对发病已出现症状或典型症状的家兔免疫效果较差，有时还有加速家兔死亡的情况发生。二联苗安全性好，预防免疫怀孕兔无流产征兆和流产，奶兔也未发现不良反应和死亡，商品幼兔在断奶后重新加免一次，可获得终身免疫。(2)免瘟、巴氏杆菌病、魏氏梭菌病三联灭活苗。免瘟、巴氏杆菌病、魏氏梭菌病是由不同的病原微生物引起的兔的三种传染病。由于这三种病发病率和致死率较高，对养兔业威胁极大。兔三联苗价格低廉，便于贮存、运输及使用。许兰菊、张书松等用人工感染兔瘟病兔的肝、脾、肾及从患急性巴氏杆菌病和魏氏梭菌性肠炎病兔分离的细菌制成氮氧化铝甲醛灭活苗(兔三联苗)。吴强、刘洪斌等【50】研制了兔瘟、巴氏杆菌病、魏氏梭菌病三联浓缩疫苗，该疫苗浓缩后每只家兔每次只需接种lml，不仅免疫效果未受影响，而且还具有使用方便、副作用小等优点。徐为中、薛家宾等【5l】通过抗原浓缩制备了兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A型)三联氢氧化铝浓缩灭活疫苗，该三联浓缩苗在240d对兔瘟的保护率仍然可达到100％。 文献综述(3)兔瘟、巴氏杆菌、魏氏梭菌、波氏杆菌四联苗。丁勇于1999年成功研制了兔瘟、巴氏杆菌、魏氏梭菌、波氏杆菌四联苗，该联苗克服了联苗混合时各基础苗的含量不足及生产量低等缺点。同时安全可靠，免疫性能好，免疫持续期达半年以上。四联苗具有简化免疫程序，一次性完成商品肉兔应免疫苗，既省力、省财，又减少应激次数等优点，利于推广应用。2噬菌体展示及随机肽库技术2．1噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术是由Smith在1985最先提出来的，其将外源基因插入丝状噬菌体fl的基因III，使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面【521。噬菌体展示技术的原理是将蛋白质或多肽的DNA序列插入到噬菌体颗粒外壳蛋白的一个结构基因的适当位置，外源基因随外壳蛋白的表达而表达，由于被修饰了的外壳蛋白仍然保持与噬菌体颗粒的兼容性，．外源基因产物随病毒颗粒的重新组装而展示到病毒外壳蛋白的表面【531。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物活性。通过反复的亲和选择和扩增，可直接测定所展示的多肽或蛋白质某些区域的生物活性，并分离出带有目的基因的噬菌体。对分离出来的噬菌体进行测序，便可知道噬菌体展示多肽或蛋白质的氨基酸序列，进一步反应了与这些多肽或蛋白特异性作用的分子学特性。2．2噬菌体展示系统分类根据表达外源蛋白的噬菌体类别的不同，噬菌体展示系统包括以下五类：(1)丝状噬菌体展示系统丝状噬菌体是一个能够感染革兰阴性菌的细菌病毒大家族，属于单链DNA病毒，包括M13，fl和fd噬菌体。基因组比较小，大小约为7000个核苷酸，为一个单链闭环DNA分子，被包装在衣壳蛋白中。丝状噬菌体与其他的细菌病毒不同，在所感染的宿主细菌中不会破坏细胞或使细胞裂解，而是以分泌形式扩增，在噬菌体肽库扩增中，每个感染细胞内每代可产生上百个病毒颗粒，因此可获得高滴度的噬菌体(约1010．1012pf-u]m1)[S4,5s]，以满足库容的需要。目前M13噬菌体的全部核苷酸序列已测定清晰，已知在基因Ⅱ和Ⅳ之间有508个核苷酸的间隔区，外源DNA片段插入这个区域对噬菌体几乎没有影响。丝状噬菌体有5个衣壳蛋白，即主要衣壳蛋白pⅧ和4种次要衣壳蛋白pHI、pVI，pⅦ和pIX。在丝状噬菌体展示系统中，主要的展示蛋白是pm和pⅧ蛋白。pIII蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋白质的大小无严 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立格限制。可以用作筛选高亲和力的抗原决定簇，故大多数研究者常利用priI作为外源多肽或蛋白融合部位，但pⅢ很容易被蛋白酶水解，在免疫学和生物疫苗研究中受到限制。pl刀ll拷贝数多达2700个左右，因此用pVl可筛选低亲和力的配体，但小分子质量的pV]ll不能容纳多于6个氨基酸残基外源多肽，使外源肽与pVl的融合受到限制。丝状噬菌体有一个非常重要的特点，即具有非常好的免疫原性，有实验表明，产生抗fd的抗体不需要任何佐剂，这一特性在进行生物疫苗的开发上具有重要价值。(2)九噬菌体展示系统九噬菌体为两端不闭合的线形双链DNA，噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体头部D蛋白的N端和尾部V蛋白的C端，它们的拷贝数分别为405和192，都可以多拷贝的展示外源蛋白‘56，571。噬菌体是在宿主细胞内完成装配，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜，可展示有活性的大分子蛋I刍(100kDa以上蛋白)及对宿主细胞有毒性的蛋白，适用范围极广。噬菌体展示另一个显著的优势是能够高水平地与D蛋白融合表达多种真核蛋白。HerrmannS【58】指出这可能是由于D蛋白作为外源蛋白的分子伴侣以保证融合蛋白在原核细胞中正确折叠。日前，用入噬茵体展示系统己成功展示了具有活性的B一半乳糖营酶和BauhiniaPurpurea凝集素。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子／噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了噬菌体的尾部装配【59】(3)T4噬菌体展示系统该展示系统是将外源多肽与T4噬菌体的小外衣壳蛋白(smalloutcapsidprotein，soc)c端融合而被展示【601。T4噬菌体的基因组为双链线性DNA，SOC是一个相对分子质量为9kD的小蛋白，是T4组装所必需的【6l】，而且不论在体内还是在体外，它都具有与成熟衣壳表面的特定位点专一性高亲和力地结合的能力。T4噬菌体在宿主细胞内组装不需要通过分泌途径，因此可以展示的多肽范围广，尤其适用于展示那些不能被E．coli分泌的复杂蛋白质。(4)T7噬菌体展示系统T7噬菌体展示系统是Novagen开发的基于T7噬菌体基因的研究产品。T7噬菌体衣壳蛋白通常有两种形式，即10A(344个氨基酸)和10B(397个氨基酸)，目的序列(C一端)与T7基因10衣壳蛋白而表达得到的多肽和蛋白即可展示在T7噬菌体的表面。其同样不需要通过细胞膜分泌出来，因此其展示多肽和蛋白的范围较广。T7噬菌体展示系统以高、中、低拷贝表达各种蛋白。极高拷贝数载体适合用于低亲合力的lO 文献综述结合域，中拷贝展示载体适合用于分析中等亲和力的结合域，低拷贝数载体适合用于分析高亲和力结合域。T7易于操作、表达能力强、亲和淘洗富集性好，生长极为迅速，稳定，能在各种严酷的条件下不被破坏。因此，其将被广泛应用到多种目标分子的筛选。目前，已经有学者利用该系统成功构建了前列腺癌的eDNA文库，并筛选出了诊断早期前列腺癌的一组抗原【62】，该方法也很好的应用到了乳腺癌诊断标识方面的研究【63】。(5)噬菌粒展示系统噬菌粒(phagemid)实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，噬菌粒带有M13(单链)和质粒(x2链)的复制起始位点，既能像质粒一样快速复制，也能在辅助噬菌体如M13K07的帮助下，装配成重组噬菌体颗粒。噬菌粒是一种“假”噬菌体，其复制、包装等功能均有辅助噬菌体提供。适当的抗性选择标记能够使噬菌粒DNA和辅助噬菌体DNA共存于细胞中，而辅助噬菌体本身并不能复制、包装，由此形成的噬菌粒也可以用来表达外源肽，并且噬菌粒比常规噬菌体展示较少的肽，展示肽可以与噬菌体单价结合，因此可以用来筛选高亲和力的展示肽。2．3噬茵体随机肽库噬菌体随机肽库技术实际上是噬菌体展示技术的一种应用，该技术是将一段编码外源短肽的寡聚核苷酸整合到噬菌体基因中，以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达，从而构建成不同的特定长度的小肽集合【删。噬菌体随机肽库的优点是：筛选方法简便有效，用亲和选择系统即可；可得到一些自然界中不存在，但能与靶分子具有高亲和力的新的配体分子；筛选可得到能替代大分子药物的活性小肽，给临床治疗带来一定程度的革新：通过研究筛选到的小肽与已知蛋白的相互作用机制，可预测蛋白的未知活性区；由生物体转录翻译产生的多肽具有生物活性，无需纯化，并达到70．94％的纯度；从噬菌体随机肽库中得到的多肽已是一个融合型分子，不需要将多肽与载体连接；多肽可通过噬菌体扩增而增加，操作方便，实验费用低。噬菌体肽库一般采用生物筛选技术进行淘筛。根据靶分子所处的状态不同，可将筛选分子分为固相筛选和液相筛选。固相筛选和标准的酶联免疫吸附法(ELISA)类似，直接将靶分子包被到ELISA板上。液相筛选通常是将靶分子和生物素相联，噬菌体与溶液中的已生物素化的靶分子相互作用后，加入到包被有亲和素的塑料管或平皿中，洗涤除去未结合的噬菌体，其余的操作流程两者相同：包被靶分子：封闭特异性结合位点；加入噬菌体肽库共孵育；洗掉未结合的噬菌体：洗脱专一性结合的噬菌体；感 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立染对数期的宿主菌；扩增筛选到的噬菌体。筛选过程如图1。图1噬菌体随机肽库的筛选过程Fig．1Thephageaffinityselectioncycle固相筛选法的特点【651是操作简单，筛选出阳性克隆的几率高，但需要纯化大量的靶蛋白纯品，而且不太容易根据抗体库和抗原的性质进行量化处理，因而针对抗体的亲和力有所选择时此法效果欠佳。液相筛选法的优点是增加了噬菌体颗粒与抗原接触的几率，因此提高了筛选效率；筛选体系可以根据抗体库的库容、抗原的相对分子量和纯度等对筛选体系进行调整；可以预先确定所期望抗体的亲和力，能够选择性地筛选到不同亲和力的噬菌体抗体【661。但是液相筛选获得的克隆特异性比较差。2．4噬菌体展示技术的应用(1)筛选抗原表位噬菌体展示技术在抗原表位的筛选方面的应用极为广泛，在该研究中，以抗体作为靶物质，经过亲和筛选，获得与抗体特异性结合的噬菌体克隆，扩增阳性噬菌体克隆即可提取这些阳性单克隆的DNA，通过测序得到展示多肽的序列，进而推断出抗原的表位或模拟表位。噬菌体随机肽库用于蛋白质抗原表位分析，弥补了合成肽筛选的不足，在研究线性短肽、折叠的蛋白质，甚至非蛋白质分子等受体的相应配体时， 文献综述噬菌体随机肽库被认为是配体的“万能库”，这些配体不一定和天然的配体完全相同，但是能模拟天然配体的结合特性。倪宏波等利用噬菌体展示肽库进行亲和筛选得到了边缘无浆体膜表面蛋白5的模拟表位，确定该表位为线性表位，为边缘无浆体诊断和新型疫苗的研制奠定基础【67】。徐和敏等通过建立CSFV噬菌体展示多肽库，采用7株猪瘟单克隆抗体和l株猪瘟高免血清分别对构建的SM．E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛，获得了与E2蛋白高度同源的序列，其代表了抗原E2蛋白的表位【6引。CAIJiong等以2009年甲型H1N1流感康复患者的血清作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机环七肽库进行亲和筛选。得到12个阳性克隆，确定氨基酸序列PLHARLP为甲型H1N1流感病毒抗原的模拟表位，其表位由HA的第52、53、59、60、61、83和271位氨基酸共同构成。流感病毒表位的研究，为开展用流感病毒模拟表位探索新的流感防治方法奠定了基础1691。Pereboeva等人也利用亲和层析法从两个噬菌体随机肽库中筛选到丙型肝炎病毒的核心蛋白、NS3及NS4蛋白的多个抗原表位【7UJ。(2)抗体工程的研究噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用上的一个成功范例。它可以模拟体内B淋巴细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。建库时一般先从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA，设计核酸引物，用PCR技术扩增出所需要的整套的抗体基因片段，通过抗体轻链和重链基因的随机重组，构成单链抗体基因，将其插入噬菌体或噬菌粒表达载体中，与噬菌体外壳蛋白基因连接，感染大肠杆菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌体表面，形成含有全套抗体谱的噬菌体抗体库。利用抗原．抗体的特异性结合进行淘选，获得能与抗原特异性结合的阳性克隆。该方法与传统的杂交瘤技术制备单克隆比较，具有简单、快速、高效的优点，更重要的是应用该技术可以扩大筛选的范围，筛选出不同亲和力的抗体。张晴晴等从噬菌体单链抗体库中利用固相亲和筛选方法获得了4株抗玉米玉米赤霉醇(ZER)的阳性克隆，并对这些阳性克隆进行原核表达。该研究为在天然噬菌体抗体库中制备玉米赤霉醇的抗体奠定了基础【7l】。杨涛等人构建了抗肿瘤坏死因子0【(tumornecrosisfactora，TNF．0【)单链抗体(singlechainFv,scFv)文库，并对其进行了筛选，获得了高亲和力的抗TNF．ascFv，为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础【721。李佳等对酵母细胞RNR3蛋白序列中高度保守片段RNR3h进行原核表达，并从噬菌体抗体库中筛选得到3种单链抗体，均可以识别该片段的空间抗原位点，噬菌体抗体库的应用为研究酵母细胞蛋白提供了更多的途径【73’。 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立(3)疫苗研究丝状噬菌体具有免疫原性，无须佐剂即可产生抗体，这意味着噬菌体展示系统可以作为候选疫苗抗原表位的递呈工具。从噬菌体展示肽库中可以筛选展示在噬菌体表面的抗原表位，只要它是针对某种疾病的中和性表位，就可以发展成为特异性疫苗。针对某种病原上特定抗原表位的疫苗研究表明，动物接种重组噬菌体粒子后，可产生B细胞抗原表位(Bepitope)和模拟抗原表位的特异性抗体，也能诱导特异性CTL应答【741。Keller等删研究发现采用抗HIV-Igpl20蛋白的单克隆抗体筛选获得的噬菌体模拟表位，免疫动物后能够诱导产生针对gpl20蛋白的特异性体液免疫应答。Wu等【7叼鉴定了乙肝病毒的模拟表位，免疫小鼠可诱导产生比天然抗原表位更高滴度的抗体。利用展示肉毒梭菌中和表位的噬菌体不加佐剂直接免疫小鼠，血清ELISA检测显示，免疫小鼠是对照小鼠的OD值的2．10倍。表明噬菌体展示的表位具有明显的抗原性。OsmanyGL等【77】首次将噬菌体展示肽库技术应用到筛选甲型肝炎病毒抗原决定簇中，试验通过对肝炎病人的血清进行亲和筛选从而得到4个不同的重组肽，其中有3个重组肽的氨基酸序列至少含有甲型肝炎病毒的VP3和VPI抗原蛋白质中的1种，其中1个重组肽阳性血清检出率为92％。应用试验产生的模拟表位抗原肽刺激小鼠，后者产生中和抗体可与其体内的甲型肝炎病毒反应，起到了较好的免疫保护作用。何金桃等从噬菌体展示eDNA文库中筛选得到了1O种阳性噬菌体克隆，并用这些克隆进行免疫小鼠，观察其对血吸虫的免疫预防效果，结果显示这些阳性噬菌体克隆在一定程度上可以预防日本血吸虫，在血吸虫疫苗研究方面具有重要价值【_78l。贾人初等也对利用噬菌体文库对血吸虫进行了研究，获得的噬菌体克隆可以诱导显著的杀虫效果【79】O(4)疾病诊断和治疗用噬菌体表面展示技术发展血清学诊断方法具有明显的可行性与重要性。SebastienH等[SOl先将西尼罗河病毒的E蛋白DI]J(Epl5)抗原表位双倍克隆，即将Epl5x2克隆进T7噬菌体展示系统，在该系统中Epl5x2可作为重组抗原检测西尼罗河病毒的IgG。应用66例人血清样品进行试验，与商品化的试剂盒相比该检测方法敏感性达67％，特异性达100％。从该方法的稳定性、抗原制备的难易程度及T7噬菌体展示系统的性质等方面考虑，学者们认为该方法可用于制备高敏感性和特异性抗西尼罗河病毒免疫球蛋白诊断试剂盒。肿瘤血管表达有正常血管内皮细胞没有或微量表达的蛋白，针对它们具有的特征性结构，用噬菌体展示技术可以筛选出特异识别这些蛋白的多肽。Kelly等【8l】以血管细14 文献综述胞黏附分子21(VCAM21)家族蛋白为靶标，用噬菌体展示技术筛选出了包含VHSPNKK序列的特异性多肽。将此多肽和磁性荧光纳米颗粒连接起来，并在体内用于肿瘤坏死因子A诱导的炎症小鼠模型的治疗，发现该复合物对表达VCAM21的细胞有很高的亲和力，与巨噬细胞的亲和力却很低：而无VHSPNKK序列的对照组纳米颗粒对肿瘤血管内皮细胞则没有亲和力。由于特异性识别多肽可以与肿瘤血管内皮细胞上具有的特征性结构发生特异性结合，故将其和药物或者药物载体等偶联起来，则能更好实现特异性靶向治疗肿瘤的目的，在明显抑制肿瘤生长的同时，极大程度地减少化疗药物的毒副反应。Magdesian等【82】利用噬菌体展示技术筛选出可特异结合p淀粉样蛋白(Ap)的七肽IQ(与Ap具有纳摩尔水平的亲和力)。该肽与nAChRs上Ap结合位点具有同源性，可以竞争性抑制A13与nAChRs的结合，从而减少AB对nAChRs的毒性效应。利用噬菌体随机肽库可筛选有效的药物靶点，在药物筛和疾病治疗方面发挥重要的作用【83】。Jin等【州利用噬菌体展示技术，通过固定化阿霉素筛选T7噬菌体人类肝脏的cDNA文库，得到了阿霉素的靶点蛋白hNoppl40，它是一个重要的核仁发生因子，在大肠杆菌中表达此蛋白，研究揭示了阿霉素通过作用于hNoppl40的抗肿瘤机制。研究结果证明在进行药物靶点筛选和验证方面，噬菌体展示筛选系统的展示克隆技术是一个有效、快捷的方法。自从噬菌体展示技术问世以来，已被广泛应用于生命科学基础性研究的各个领域。除了上述各个研究领域以外，该技术在很多新的领域也得到了广泛的应用，并获得较好的成果。比如，蛋白与蛋白之间相互作用的研究【85】，食品中毒素的检测【跚，蛋白分子生物学研究【87】，蛋白质芯片的无标记检测中的应用【881，纳米材料合成中的应用[891。由于该技术具有如此强大的优势和应用价值，其必将会得到越来越大的推广。 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立参考文献【l】LicalsiC，ChristensenT’BennetlJV酣aLDrypowderinhalationasapotentialdeliverymethodforvaccines【J】Vaccine，1999，17(13—14)：17796-17803．【2】2ArguelloVillaresJL，Ⅵralhaemorrhagicdiseaseofrabbits：vaccinationandimmuneresponse【J】．RevseiTechIntEpiz,1991，(10)：471-480．【3】蒋淑君，许兰芝．淫羊蕾总黄酮的药理作用研究进展[J】．中医药学报，2004，32(4)：61-63．f4】周黄金主编．中药免疫药理学p川．北京：人民军医出版社，1994，134．【5】毛小娟．红茂多糖和黄茂多糖的免疫调节作用【J】．中国药理学通报，1989，5(6)：367．【6】6贺新怀主编．中医药免疫学【M】一匕京：人民军医出版社，2002，132．【7】王天然．淫羊萦多糖对初次、再次体液免疫应答的作用【J】．中药药理与临床，1989，5(1)：11．【8】杜念兴．一种新病毒一兔出血症病毒的鉴定初报【J】．病毒学报，1986，2(2)：146—151．【9】樊英达．家兔出血症病毒宿主范围研究【J】．上海畜牧兽医通讯，1987，(4)：7-9[10】曹树泽等．兔病毒性出血症肺炎(暂定名)调查研究初报[J】．中国兽医杂志，1986，12(4)：9．11【ll】田克恭等．兔病毒性出血症[J】．中国畜禽传染病，1990，(4)：63．65．【12】蔡宝祥主编．家畜传染病学【M】．第三版，中国农业出版社，1999，229—301．【13】沈菊英等．兔病毒性出血症的研究I兔病毒性出血症引起兔肝细胞的超显微结构病变【J】．病毒学报，1986，2(4)：32．322．【14】史同瑞等．兔病毒性出血．症的诊断与防SJJ[J]．中国养兔杂志，1996，(7)：6—7．【15】田克恭等．兔病毒性出血症阴．中国畜禽传染病，1990，(4)：63—65．【16】盛蕴纯等．家兔的一种病毒性出血症的病理学研究明【J】．上海畜牧兽医通讯，1985，(41)：3-6．【17】黄吉风，徐福南．兔出血症病毒人工感染幼兔的病理学研究【J】．南京农业大学学报，1996，19(2)：78-81．【18】王启明．兔免疫程序的探讨明．中国养兔杂志，2000，(4)：30—31．【19】王云峰，陈洪岩，夏长友，等．对兔病毒性出血症疫苗及其使用方法的几点看法田．中国养兔杂志，2002，2：14．16．[20】MeyersGWirblichC，ThielHJ，eta1．Rabbithemorrhagicdiseasevirus：Molecularcloningandnucleotidesequencingofacalicivirusgenome【J】．Virology,1991，184：664—676．[21】KonigM，ThielHJ，MeyersGDetectionofviralproteinsafterinfectionofculturedhepatocyteswithrabbithemorrhagicdiseasevirus[J】．JVirol，1998，72(5)：4492-4497．【22】UshijimaH，MiyamuraT’TakedaN．ProteolyticprocessingofsapovirusORFlpolyprotein【J】．JVirol，2005，79：7283-7290．【23】ClakleIN，LambdenPR．Themolecularbiologyofcaliciviruses【J】．JGenVirol，1997，7816 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第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位第二部分实验部分摘要为获得抗原RHDV的抗原表位，使用实验室构建的抗RHDV单抗A3e作为固相筛选分子，用噬茵体展示技术进行亲和筛选。复苏实验室保存的RHDV单抗A3c杂交瘤细胞系，并制备腹水型单抗。单抗纯化后测定其纯度、浓度、效价及亲和常数。用高活性、高纯度的单抗作为固相筛选分子，应用噬菌体展示技术进行亲和筛选，对筛选的噬茵体克隆进行鉴定并测序，获得与抗原高度同源的序列，即抗原的表位。结果表明，制备的单抗经纯化后纯度高于80％，ELISA效价为1：81920，亲和常数为3．5x107，具有较高的纯度和活性，可以用作固相亲和筛选。经过三轮亲和筛选，有效富集了特异性噬菌体克隆。用夹心ELISA方法鉴定，结果表明，25个噬菌体克隆中19个为阳性克隆．竞争ELISA方法进一步验证了这些克隆与单抗的结合具有特异性。接下来对阳性噬菌体克隆进行测序，结果表明，获得了与抗原高度同源的序列GTDDⅧPCTrAA，即抗原的模拟表位。其中，氨基酸基序DXXDP为表位中的核心氨基酸。该研究为RHDV分子生物学的进一步研究和新型疫苗的探索提供基础。关键宇：兔出血症病毒；单克隆抗体；噬茵体展示技术；模拟表位 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立SCREENINGOFANTIGENMIMOTOPESOFRHDVBYPHAGEDISPLAYTECHNOLoGYABSTRACTInordertogettheepitopeofRHDV,theMcAbA3cagainstRHDVdevelopedbythelaboratoryhadbeenusedassolid-phaseselectivemoleculetoscreenbyphagedisplaytechnology．McAbA3chybridomacellstrainagainstRHDVinthelaboratoryWasrecoveredandtheascitesantibodyWasprepared．Thepurity,concentration，titerandtheaffinityconstantoftheantibodyweredeterminedafterpurifying．UsinghighlypureandactiveMeAbassolid-phaseselectivemolecule，thebiopanninghadbeendonebyphagedisplaytechnology．11lephageclonesselectedweredeterminedandsequencedtogethighlyhomogenoussequencecomparingtoantigen，whichistheantigenepitope．TheresultsshowedthatthepurityofMcAbA3cWasmorethan80％，theELISAtiterWas1：81920andtheaffinityconstantwas3．5x107afterpurifying．ThepurifiedMcAbCanbeusedassolid-phaseselectivemolecule．Afterthreeroundsofbiopanning，thespecificphageswereenrichedeffectively．ThesandwichELISAshowedthat19outof25phagecloneswerepositiveandthecompetitiveELISAfurthersuggestedthatthepositivephageclonescanspecificallybindtothemonoclonalantibody．Thesequenceanalysisofthepositiveclonesshowedthathighlyhomogenoussequence(GTDDMDPGTTAA)comparingtoantigenwasgot,whichistheantigenmimotopesofRHDV．ThesequenceDXXDPWasthecoreaminoacidsinepitope．，nlestudywillprovidetheoreticalbasisforstudyingthemolecularbiologyofRHDVandnewvaccines．KEYWORDS：Rabbithemorrhagicdiseasevirus；Monoclonalantibody；phagedisplaytechnology；mimotopes24 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位兔出血症(RabbitHemorrhagicDisease，RHD)俗称兔瘟，是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)引起的一种高度接触传染性、急性、致死性传染病，以传染性强、呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征【l】，流行特点是潜伏期短，发病快，死亡率高，流行范围广[21。RHDV的基因组为单股正链RNA，全长7437bp，分子质量为2．4x103ku～2．6x103ku，5’末端无帽状结构，而是与感染性有关的Vpg(Vh-ionproteingenomelinked，Vp曲共价结合，3’末端具有一个短的poly(A),l君／3’4j。基因组的1bp---9bp为5’非编码区，最后59bp为3’非编码区。该病毒基因组结构仅含有两个开放阅读框架(openreadingframe，ORF)t51。病毒的衣壳蛋白VP60是RHDV的主要结构蛋白，它在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。研究表明，病毒衣壳上具有两个主要抗原区域，分别位于VP60蛋白N端的第31位到第250位氨基酸之间和C端的第477位到第579位氨基酸之间，但最主要的抗原区可能位于VP60蛋白N端【6】。研究者们推测病毒VP60蛋白羧基端的抗原结构主要是依赖于构象决定簇的B细胞位点，而蛋白的氨基端则是线形的抗原决定簇，其在病毒感染和灭活疫苗的免疫中诱导机体产生免疫应答【7】。噬菌体展示技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术。这项技术的主要原理是将蛋白质或多肽的DNA序列插入到噬菌体颗粒外壳蛋白一个结构基因的适当位置，外源基因随外壳蛋白的表达而表达，由于被修饰了的外壳蛋白仍然保持与噬菌体颗粒的兼容性，外源基因产物随病毒颗粒的重新组装而展示到病毒外壳蛋白的表面[81。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物活性。通过反复的亲和选择和扩增，可直接测定所展示的多肽或蛋白质某些区域的生物活性，并分离出带有目的基因的噬菌体。噬菌体展示技术具有多种用途，包括未知的抗原表位的寻找、疾病检测、研制新型疫苗、多肽药物筛选等。对于抗原表位寻找的应用上，已有大量的报道【9‘121。本研究拟利用本实验室构建的抗RHDV单抗A3c，用噬菌体展示技术筛选RHDV的抗原表位，该研究将为进一步了解RHDV病原的生物学特性及新型疫苗的研究奠定基础。I材料与方法1．1材料1．1．1生物材料及试剂盒 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立(1)Ph．D．．12噬菌体展示肽库试剂盒，购自NewEngliandBiolabs公司，库浓度为1x1013pfu／ml，随机多样性为2．7x109，受体菌为E．coliER2738。(2)抗RHDV单克隆抗体A3c杂交瘤细胞系，本实验室保存。(3)兔抗M13噬菌体多抗，由江苏省农科院国药中心徐海老师惠赠。(4)抗原VP60重组蛋白，本实验室制备并保存。(5)单抗Ig亚型试剂盒，购自Thermo公司。1．1．2主要试剂(1)EB、琼脂糖，均购自南京基天生物技术有限公司。(2)牛血清白蛋白(BSA)，购自生物晶美公司。(3)聚乙二醇．8000，购自AMRESCO公司。(4)酵母提取物(yeastextract)，购自OXoidLit公司。(5)胰蛋白陈，购自OXoidLit公司。(6)IPTG、X．Gal，购自武汉博亚生物技术有限责任公司。1．1．3主要仪器(1)超净工作台，ZHJH．1209型，购自上海智城分析仪器制造有限公司。(2)酶标仪，340rt型，购自Anthos公司。(3)台式冷冻离心机，购自Eppendorf公司。(4)微量加样器，为Eppendorf公司产品。1．1．4实验动物BALB／c小鼠(雌性，6周龄)，购自扬州大学比较医学中心。1．2方法1．2．1兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化1．2．1．1兔出血症病毒单克隆抗体的制备(1)杂交瘤细胞的复苏将液氮罐保存的RHDV杂交瘤细胞株A3c迅速放入37。C温水中，快速搅动使其短时间内融化，1000r／min离心3min，使细胞沉淀，无菌弃去冻存管中的上清液，将沉淀细胞迅速溶于完全DMEM培养液，加入细胞瓶，补足营养液，放入37℃、5％C02的培养箱进行培养，2-3天后，用倒置显微镜观察，待细胞生长至致密的单26 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位层后，分装到三个细胞瓶中进行扩大培养，然后将培养瓶放入37℃、5％C02的培养箱中，每24h换液一次。(2)腹水的制备将O．5ml高压灭菌的石蜡油注射到BALB／e小鼠腹腔，一周后注入106个杂交瘤细胞。5～7天后，当小鼠腹部极度膨胀且行动迟缓时抽取腹水，将腹水3000r／min离心10min，弃去脂肪收集中间澄清腹水，冻存备用。1．2．1．2单抗A3c亚型的鉴定利用Thermo公司Ig亚型测定试剂盒，检测单抗A3c杂交瘤细胞的培养上清液。1．2．1．3辛酸．硫酸铵法纯化单抗A3e1．透析袋的处理：(1)将透析管剪成适当长度(10-20cm)的小段，即形成透析袋。(2)在大量的2％(m／v)NaHC03和1mmolEDTA(pH8．0)的溶液中将透析袋煮沸10min。(3)将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。(4)将透析袋置1mmol／L的EDTA(pH8．0)中煮沸10min。(5)待透析袋冷却，存放4"C，应确保透析袋始终浸没在液体中。(6)在使用前要使用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。2．辛酸．硫酸铵法纯化单抗A3e：(1)取RHDV单抗腹水8ml，离心除去表层脂质。(2)用32ml，60mmol／L的醋酸钠．醋酸缓冲液稀释，并用0．1mol／L的氢氧化钠调混合液pH至4．5。(3)将辛酸逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，每毫升腹水加入33m辛酸，加完后继续搅拌30min。(4)4。C，9000rpm，离心30min，取上清按体积比10：1与PBS混合，用0．1mol／L氢氧化钠调pH至7．4。(5)加入等体积的饱和硫酸铵溶液，继续搅拌30min，然后静置30min(6)4℃，9000rpm，离心30min，弃上清。(7)将沉淀用适量PBS溶解后吸出并装入透析袋内，于4。C条件下，加100倍体积的PBS透析24h，中途换液3~4次。(8)取出透析袋，吸出蛋白溶液，在4。C条件下，以4000rpm离心15min，取上清即为纯化产物，分装后于．20℃保存。 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立1．2．1．4纯化后单抗A3c纯度的鉴定用SDS．PAGE电泳鉴定纯化后单抗A3e的纯度，具体步骤如下：将稀释好的单抗A3e与上样缓冲液混合以后，煮沸5min，作为电泳的加样液。(1)玻璃板用去离子水冲洗干净，选择合适的电泳槽，将玻璃板固定在电泳槽上。(2)按照表中配方(表1．1)配制分离胶和浓缩胶，先配制分离胶，用双蒸水封项。待分离胶凝固后，倾倒出上层液体，双蒸水冲洗分离胶上部3次，配制浓缩胶，插上梳子，等待浓缩胶凝固。(3)待浓缩胶凝固后小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris．甘氨酸缓冲液，用注射器冲洗加样孔数次，将电源正极与下槽相连。(4)用微量加样器每孔上样20ul，作好记录，打开电源，跑浓缩胶，用90V电压，当溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。(5)染色：取下凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，缓慢振荡2h。(6)脱色：弃去染色液，加入脱色液脱色，其间更换脱色液3~4次，待蓝色背景基本脱净后，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色。表1．1蛋白电泳的分离胶和浓缩胶配方Tablel-lFormulaofseparationgelandspacergelinproteinelectrophoresis12％分离胶(20mL)ddH2030％双丙烯酰胺混合液1．5MTris-HCI(pHS．8)10％(WN)SDS10％过硫酸铵TEMED5％浓缩胶(8InL)ddH2030％双丙烯酰胺混合液1．0MTris—HC1pH6．810％(w／v)SDS10％过硫酸铵TEMED6．6mL8．0mL5．0mL0．2mL0．008mL5．5mL1．3mL1．0mL0．08mL0．008mL 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位1．2．1．5纯化后单抗A3c浓度的测定：利用核酸蛋白分析仪测定抗体蛋白的浓度。1．2．1．6纯化后单抗A3e效价的测定间接ELISA方法测定纯化后单抗的效价：(1)用包被液将抗原VP60稀释，包被酶标板，每孔100ul，轻振酶标板，使抗原在孔底均匀铺开，4"C过夜吸附，次日用PBST洗涤液洗涤3次，每次5min，拍干水分。(2)用2％明胶封闭，每孔200ul，37"C作用2h，再用洗涤液洗板3次，每次5rain，拍干水分。(3)用PBS对单抗A3c做2倍比稀释，加入到酶标板中，每孔100ul，同时设立阴阳性对照，37"C作用90min，再用洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(4)加入1：2000稀释的酶标羊抗鼠IgGl00ul，37"C作用60min，再用洗涤液洗板7次，每次5min，拍干水分。(5)加入新鲜配制的TMBS．H202底物显色液，每孔100ul，37"C避光显色10min。(6)加入2mol／LH2S04终止液，每孔50ul终止反应。(7)在酶标免疫测定仪上测定450nln波长下的OD值。(8)判定单抗的效价。1．2．1．7纯化单抗A3e亲和力的测定参照文献[133选用间接ELISA方法测定，即用抗原VP60分别以1：100、1：200和1：400的稀释液包被96孔酶标板，加入倍比稀释的单抗A3c，再加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体，显色液显色，测定OD450值，以抗体浓度的对数为横坐标，以OD450值为纵坐标，由此可得出3条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的OD450值作为100％，在曲线上查出50％OD450值时相对应的抗体浓度，按Beatty推导公式：磁萨(n．1)／2(n[Ab’】-【Ab】)计算亲和常数。其中n=[Ag]／[Ag7】；【Ab’】、lAb]分别代表抗原浓度分别为[Ag’】、【Ag]时50％OD450对应的抗体浓度。1．2．2噬菌体展示肽库的亲和筛选1．2．2．1宿主菌ER2738的复苏与保存将肽库试剂盒中的ER2738菌株10ul接种至3mlLB—Tet液体培养基中，37"C，250rpm振荡培养约9h。将上述菌液全部转入20皿LB．Tet液体培养基中，37"C，250 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立rpm振荡培养5“h。将上述20ml菌液分装于2ml冻存管中，每管O．5ml，加入等体积灭菌甘油，充分混匀后保存于．70"C冰箱中。用时取冻存管一支，点取菌株划一块LB．Tet平板，37。C温箱培养12h，平板密封后置4"C冰箱避光保存备用。接菌时点取一个分隔良好的单克隆菌落，在3mlLB．Tet液体培养基中，37"C，250rpm振荡培养。1．2．2．2第一轮噬菌体筛选参照噬菌体肽库试剂盒提供的说明书，略加修改，具体如下：(1)用0．1MNaHC03(pH8．6)溶液将纯化的RHDV单抗A3c稀释成50ug／ml，加入到ELISA微孔中，每孔100ul，共4孔。于4"C湿盒中过夜。(2)倒出每个板中的包被液，对着干净的纸巾使劲拍打以去除残留液体。每个孔加满封闭缓冲液，37"C孵育2h。(3)用TBST(TBS+0．1％Tween．20)快速洗涤6次，反复涡旋以确保孔底及孔侧面都被洗涤，洗涤要迅速，避免干燥，每次更换纸巾，避免交叉污染。(4)取400ulTBST和10ul肽库(10¨pfu)混匀，加至封闭后的酶标板中，室温下轻缓摇动60min。(5)吸出未结合的噬菌体上清以去除未结合噬菌体，用TBST洗涤板子10次，每次更换洁净的纸巾，避免交叉污染。(6)每孔加入100ul洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体，室温下轻缓摇动8min，将洗脱液转至1个EP管中，以60ul1MTris．HCI(pH9．1)中和，此为第一轮噬菌体洗脱液。1．2．2．3噬菌体滴度测定(1)在LB．Tet平板上挑取ER2738单克隆，接种至5mlLB液体培养基，37℃培养过夜。(2)微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml，维持在45"C备用。(3)37℃预热LB／IPTG／Xgal培养板，备用。(4)取2u1噬菌体作适当稀释，每个稀释度的噬菌体取10u1与200ul生长至对数中期的ER2738培养物混合，快速涡旋，室温孵育5min。(扩增前后的噬菌体稀释方法分别为：用LB培养基对扩增前噬菌体分别做102、103、104、105倍稀释，对扩增后噬菌体分别做108、109、1010、1011倍稀释。)(5)转移至含有3ml45。C顶层琼脂糖凝胶的试管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的LB／IPTG／Xgal平板上，轻缓摇动平板使顶层琼脂分布均匀。(6)冷却平板5min，37"C倒置培养过夜。 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位(7)第二天选取噬斑数为100左右的平皿对噬斑计数，按下述公式计算噬菌体滴度：噬菌体滴度(pfu／u1)=(噬斑数目×稀释倍数川O。1．2．2．4噬菌体扩增(1)在LB．Tet平板上挑取ER2738单克隆，接种至5mlLB液体培养基，37。C过夜培养。(2)用LB以1：100稀释ER2738过夜培养物至20ml，加入噬菌体洗脱液，37℃剧烈振荡培养4．5h。(3)将培养物转移到一个离心管中，4。C，14000rpm离心10min。将上清转移到一个新管中，再离心一次(弃沉淀)。(4)取80％上清加入1／6体积的20％PEG／2．5MNaCl，颠倒混匀，4"C沉淀过夜。(5)4。C，14000rpm离心15min，倾去上清，再次离心，吸去多余上清。噬菌体沉淀应该是一种贴在管壁上的白色指纹状。(6)在lmlTBS中重悬沉淀。将悬液转移到一新微量滴定管中，4"C最大转速(14000rpm)离心5min，沉淀残留细胞。(7)将上清转入新的EP管中，加入1／6体积的20％PEG／2．5MNaCI再沉淀。冰上孵育60min。(8)4。C14000rpm离心10min，弃上清。简单的再离一次，用移液枪除去残留上清。(9)用200ulTBS悬浮沉淀，离心1min，将上清转入新管中，此即为扩增的噬菌体洗脱液。1．2．2．5第二轮和第三轮筛选第二轮和第三轮亲和筛选参照第一轮的筛选过程。靶物质单抗A3e的包被浓度不变，为了增加筛选过程中的强度，增加洗涤液中Tween-20的浓度，分别为O．3％和0．5％。每轮加入的噬菌体分别为上一轮洗脱液扩增后的保存液。加入噬菌体的量与第一轮保持一致。1．2．2．6噬菌体单克隆的制备(1)将第三轮筛选后获得的未扩增洗脱液按上述噬菌体滴度测定的方法铺板。(2)筛选噬斑数在100以下的平板，用灭菌枪头随机挑取25个分离较好的蓝色噬斑，分别接种至2ml以LB培养基1：100稀释的ER2738过夜培养物中。(3)37。C，剧烈振摇培养4．5h。(4)将培养物4。C14000rpm离心30S。 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立(5)将上清转入新的EP管中再次离心，取上部约80％的上清转至新的EP管，即获得25个噬菌体单克隆的贮液，4℃保存备用。1．2．2．7ELISA鉴定噬菌体单克隆(1)用包被缓冲液(0．1MNaHC03，pH8．6)稀释单抗A3e，浓度为50ug／ml，然后加入到酶标板中，每孔100ul，同时每个样品做一个空包被孔，作为空白对照。在一个密闭的增湿盒(如一个用湿纸巾铺的密封塑料盒)中4"C孵育过夜。(2)第二天甩掉多余的靶溶液，对着纸巾拍板。每孔加满封闭缓冲液。37。C温箱孵育2h。(3)倒掉封闭缓冲液，用TBST(TBS+0．1％Tween-20)洗板6次，每次都对着一个干净的纸巾拍板。(4)将稀释好的噬菌体样品加入到酶标板中，每个样品两孔，分别包被有单抗A3c和空包被孔。37℃温箱孵育1h。(5)用TBST(TBS+0．1％Tween．20)洗板6次。(6)将稀释好的兔抗M13抗体加入到酶标板中，37。C作用lh。(7)用TBST(TBS+0．1％Tween．20)洗板6次。(8)将稀释好的HRP．羊抗兔抗体加入到酶标板中，37。C作用lh。(9)用TBST(TBS+0．1％Tween．20)洗板6次。(10)加入底物TMB溶液，每孔100ul，室温作用5min。然后用2MH2S04终止反应，每孔50ul。(11)使用自动酶标仪测定OD450值。1．2．2．8三轮洗脱液中噬菌体与靶分子单抗A3c亲和活力的测定使用上面ELISA方法检测各轮洗脱物中噬菌体与靶分子单抗A3c亲和活力。首先按照上述噬菌体扩增步骤扩增各轮洗脱物。然后稀释，使各轮洗脱物中噬菌体的量均为1012pfu／ml，然后加入酶标板中。其它步骤如上。1．2．2．9阳性克隆DNA序列的测定(1)碘化钠法提取噬菌体单链DNA．(a)扩增阳性噬菌体克隆：取30ul噬菌体贮液与4mlLB稀释的ER2738过夜培养物混合，37℃剧烈振荡培养4．5h。然后将培养物4。C14000rpm离心30s，取上清3ml用作单链DNA的提取。(b)加1200ul20％PEG／2．5MNaCI，颠倒几次以便于混合，让其室温静置15min。 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位(C)4"C14000rpm离心10min，弃上清(噬菌体沉淀可能不可见)。(d)简单再离心一次，小心将剩下的上清弃去。(e)加300ul碘化物缓冲液，使劲拍打离心管重悬沉淀。加750ul无水乙醇，室温孵育15min。短时间室温孵育将会优先沉淀单链噬菌体DNA，将更多的噬菌体蛋白留在溶液中。回4。C，14000rpm微量离心10rain，弃上清。用0．5ml70％酒精(保存在．20。C)洗涤沉淀(<10min)，再离心，弃上清，，在真空条件下简单干燥。Q)将沉淀悬浮于30ulTE缓冲液中。(11)用0．8％琼脂糖电泳检测提取的单链DNA。(2)DNA序列测定将提取的噬菌体单链DNA样品送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序引物为5’．CCCTCATAGTTAGCGTAACG．37，根据测序结果推导外源DNA序列的相应氨基酸序列，并将氨基酸序列与VP60氨基酸序列进行同源性比较。1．2．2．10RHDV模拟抗原表位的特异·性根据测序结果，选取可以模拟RHDV抗原表位的噬菌体克隆，用RHDV的衣壳蛋白VP60作为竞争物进行竞争ELISA实验，测定其与单抗A3c结合的特异性。(1)用包被缓冲液(O．1MNaHC03，pH8．6)稀释单抗A3C，浓度为50ug／ml，然后加入到酶标板中，每孔100ul，在一个密闭的增湿盒(如一个用湿纸巾铺的密封塑料盒)中4。C孵育过夜。(2)甩掉多余的靶溶液，对着纸巾拍板。每孔加满封闭缓冲液。37"(2温箱孵育2h。(3)倒掉封闭缓冲液，用TBST(TBS+0．1％Tween-20)洗板6次，每次都对着一个干净的纸巾拍板。(4)用TBST对重组VP60蛋白进行2倍比稀释，从l：10稀释到1：640倍，然后依次加入到酶标板中，每孔100ul，共七孔，第八孔不加VP60．每个样品一排，共三排。37℃，温箱孵育lh。(5)用TBST(TBS+0．1％Tween．20)洗板6次。(6)将稀释好的噬菌体样品加入到酶标板中，每孔100ul。37"(2温箱孵育1h。同时做一个阴性对照。(7)用TBST(TBS+0．1％Tween-20)洗板6次。(8)将稀释好的兔抗M13抗体加入到酶标板中，37"C作用1h。(9)用TBST(TBS+0．1％Tween．20)洗板6次。 应用噬菌体展示技术筛选兔出m症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立(1O)将稀释好的HRP-羊抗兔抗体加入到酶标板中，37*(2作用lh。(11)用TBST(TBS+0．1％Tween-20)洗板6次。(12)加入底物TMB溶液，每孔100ul，室温作用5min。然后用2MH2S04终止反应，每孔50ul。(13)使用自动酶标仪测定OD450值。2结果2．1兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化2．1．1单抗A3c的制备通过复苏实验室保存的单抗A3c杂交瘤细胞，扩大培养后，注射小鼠腹腔，成功获得了腹水型单抗A3c。2．1．2单抗A3C亚型的鉴定利用Thermo公司Ig亚型测定试剂盒测定，单抗A3C的亚型重链为IgGl型，轻链为Kappa型。2．1．3纯化后单抗A3C的纯度的鉴定kDa1252l①a图1．1SDS．PAGE测定单抗A3c纯度泳道1：蛋白Marker；泳道2：单抗A3cFig．1·lThepurityofMcAbA3c23kDaLane1：ProteinMarker；lane2：McAbA3c纯化后单抗A3c用12％SDS．PAGE电泳鉴定，电泳上出现两条较粗的条带，大小分别为52kDa和23kDa，分别为单抗的重链和轻链(如图1．1)，以SensiAnsys凝胶图像系统与标准样品分析表明，单抗的纯度在80％～90％之间，纯度较高。¨踮锣弘巧侈 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位2．1．4纯化后单抗A3C浓度的测定使用核酸蛋白分析仪测定单抗中总蛋白浓度为6．5mg／ml，因此，根据纯度可得单抗A3c的浓度约为5．O~6．0m幽m。2．1．5单抗A3C效价的测定应用间接ELISA方法测定纯化后单抗A3C的效价为1：81920，说明单抗纯化后仍具有较高的生物活性。2．1．6单抗A3C亲和常数的测定。利用间接ELISA方法测定单抗的亲和常数。抗原VP60以3个稀释度包被酶标板，然后2倍比稀释单抗，分别与抗原作用。最后以抗体浓度的对数作为横坐标，OD450作为纵坐标，绘制反应曲线(图l一2)。分别推导出不同浓度抗原包被的50％OD450对应的单抗的浓度，最后根据Beatty推导公式：Kalr=(n．1)／2(n【Ab，】-【Ab】)，计算出单抗A3C的亲和常数为K础r=3．5x107。其中：亲和常数大于107时，亲和常数高；小于107，亲和常数低。因此，单抗A3e的亲和常数较高。图1-2单抗A3e与抗原的结合曲线系列l、2、3：抗原稀释度分别为1：100、l：200和1：400。Fig．1—2ThecurveofMcAbA3cbindingtoAntigen。Serial1,2and3-Thedilutionsofantigenwere1：100，l：200and1：400separately． 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立2．2噬菌体展示肽库的亲和筛选2．2．1亲和筛选结果表1．2生物筛选的投入产出情况Table1-2Theratioofoutput／inputofbiopanningPfu：噬菌体的空斑形成单位Pfu：plaqueformingunits我们在固相载体上直接包被靶物质单抗A3c，筛选噬菌体肽库中的RHDV的模拟表位。总共筛选了三轮。比较三轮噬菌体的回收率，第一轮的回收率是1．2x10一，第三轮回收率为4．6x104，约是第一轮的400倍(表1．2)。表明能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了有效的富集。第三轮与第二轮筛选的回收率没有太大差别，表明特异性噬菌体在第二轮筛选过程中便得到较高的富集，也说明了亲和筛选具有较好的富集效果。2．2．2三轮洗脱液中噬菌体与靶分子单抗A3c亲和活力图1．3各轮洗脱液中噬菌体与单抗A3c的亲和活力Fig．1-3ThebindingofpolyclonalphagegotfromeachroundofscreeningtoMcAbA3c 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位应用ELISA方法测定洗脱液中噬菌体与靶分子单抗A3c的亲和活力。由图1—3可以看出，第一轮洗脱液中噬菌体与单抗A3c的亲和力较低，而第二轮和第三轮中的噬菌体与单抗A3c的亲和活性逐步增大。第三轮的噬菌体的亲和活力是第一轮的11倍，进一步表明与单抗A3c特异性结合的噬菌体通过三轮的亲和筛选得到了有效地富集。2．2．3噬菌体单克隆ELISA鉴定从第三轮洗脱物滴度测定的平板(图1—4)上共挑取了25个噬菌体单克隆。应用ELISA方法，包被单抗A3c检测噬菌体克隆的特异性。结果显示(图1．5)：25个噬菌体克隆中与单抗A3c具有很高结合活性的有16个(OD450>1．0)，比较高的有3个(OD450>0．5)，共19个，阳性率为19／25。因此，通过三轮亲和筛选，与单抗A3c特异性结合的噬菌体比重占绝大优势，得到了有效富集。图1-4第三轮筛洗脱液滴度测定平板Fig．1-4TheplaquesintheLB／IPTG／Xgalplateafterthreeroundsofscreening 应用噬菌体展示技术筛选兔出『fIL症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立图1．5ELISA测定噬菌体单克隆与单抗A3c的亲和活性。Fig．1—5ThebindingofphageclonestoMcAbA3cdetectedbyELISA2．2．4噬菌体单链DNA序列分析2．2．4．1单链DNA的提取采用碘化钠法提取与单抗A3c结合力高的阳性噬菌体克隆单链DNA，琼脂糖电泳结果显示，经碘化钠方法成功提取了单链DNA，可以用作DNA测序的模板(图l一6)。l234567Mbp50000000500＼5000+—]500图1-60．8％琼脂糖电泳分析测序模板。泳道1—7：噬菌体序列模板；泳道8(M)：DNAMarker(DLl5000)Fig．1-6Electrophoreticanalysisofsequencingtemplateson0．8％agarose．Lanel-7：sequencingtemplatesofphages．Lane8(M)：DNAmaker(DLI5000) 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位2．2．4．2测序结果：表1．3筛选的噬菌体克隆的DNA序列及相应的氨基酸序列Tablel-3DNAsequencesandPeptidesequencesoftheselectedphageclones表l-4三种氨基酸序列与VP60氨基酸序列的比较Table1-4ComparisonofthethreePeptidesequencestothatofVP60序列名称氨基酸序列VP60部分N端25．38位IS1S2S3GTTTDGMDPGVVAAG—．TDDMDPGTTAAFDLNDPATVFDFKISNFWTDMIDP应用碘化物缓冲液快速提取19个噬菌体克隆的单链DNA送英潍捷基(上海)贸易限公司测序，并推导出相应的氨基酸序列。DNA序列的两端找到了两个酶切位点：勋觚GGTACC)和Eag(CGGCCG)，说明这36个碱基是插入序列，其它的序列是噬菌体DNA序列。阳性克隆DNA序列及其编码的氨基酸序列(表1．3)。编码氨基酸的密码子均为NNK(N代表A或G或T或C：K代表G或T)，这和构建肽库所用寡核苷酸序列特征一致，说明得到的序列确为随机肽库的展示片段。测序结果中共出现三种序列，分别命名为S1、S2和S3。其中，19个噬菌体克隆中有17个噬菌体展示的氨基酸序列为S1，表明亲和筛选得到的噬菌体具有非常高的纯度。而且，与RHDV的衣壳蛋白VP60的氨基酸具有极高的同源性(12个氨基酸中有9个同源)(表1．4)。S2和S3各只有1个克隆，与VP60的同源性不是很高，但是和序列S1及VP60都具有相同的氨基酸基序DXXDP(X代表随机氨基酸)。推测该基序可能为抗原表位的核心氨基酸基序，其它氨基酸在表位中起辅助作用。从与VP60氨基酸序列的比较中可以看出，模拟表位的序列与VP60序列的N端第25位到第38位相对应，其中核心氨基酸基序位于N端第29位到33位。 应用噬菌体展示技术筛选兔'dS曲t症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立2．2．5噬菌体克隆的特异性研究图1．7噬菌体克隆与单抗A3c的特异性结合Fig．1-7SpecificbindingofphagestoMcAbA3c表1-5竞争ELISA的结果数据Table1-5ResultofcompetitiveELISA用竞争ELISA方法测定抗原VP60对噬菌体与单抗结合的特异性。首先加入倍比稀释的抗原VP60，使其先与包被的单抗作用，然后再加入噬菌体克隆，检测噬菌体与单抗A3c的结合情况。根据ELISA检测结果绘制竞争曲线(图1．7)，横坐标为VP60的稀释倍数，纵坐标为每孔的OD450值。K1和K7噬菌体克隆分别代表了Sl和S2两种氨基酸序列，而K3则为阴性噬菌体克隆，作为阴性对照。从图上可以看出，无论VP60浓度的高低，阴性噬菌体克隆K3均不与单抗A3c结合，而阳性克隆在VP60浓度较低时，可以与单抗A3c结合，说明本实验方法成立。随着VP60稀释倍数的增大，即含量的降低，噬菌体克隆K1和K7与单抗A3c结合的程度逐步增大，说明VP60 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位对它们之间的结合具有抑制作用。其中，稀释倍数在1：10到1：160时，克隆与单抗结合程度很低；结合曲线基本上与横坐标呈平行状态，说明该浓度范围的VP60对噬菌体与单抗结合起到了非常高的抑制作用。稀释倍数大于1：160稀释后，VP60对噬菌体与单抗结合的抑制作用逐渐降低。图1．8vP60对噬菌体克隆与单抗A3c结合的抑制情况Fig．1—8TheinhibitionofVP60tophagesbindingMcAbA3c根据公式：抑制率《OD无vP60．ODw60)／OD无vP60，计算VP60对噬菌体克隆与单抗A3e的抑制率。当VP60在稀释倍数为1：160、1：320、l：640时，对K1和K7的抑制率分别为0．941、0．889、0．616和0．907、0．699、0．357(图1．8)。从柱形图上可以清晰地看出随着VP60浓度的降低，其对噬菌体克隆与A3c结合的抑制率也随之降低，且VP60浓度一致时，抑制率KI>K7。结合测序结果可知，噬菌体克隆展示多肽与VP60的同源性越高，抑制率越高。上述结果说明了噬菌体克隆K1和K7与单抗具有极高的结合特异性，进一步表明了筛选出的多肽序列为VP60上的一个模拟表位。3讨论噬菌体展示技术是最近新发展起来的一项技术，其发展快速，应用广泛，尤其是在表位的研究上。比如，Krook经多轮筛选，在随机噬菌体环10肽肽库中选出了一个与A-糜蛋白酶有较强结合作用的环lO肽。该环lO肽能抑制A．糜蛋白酶的活性【121。Cook等人利用抗II型胶原蛋白单抗筛选噬菌体随机10肽库，经3轮筛选，获得7个克隆，根据这些克隆序列制备的10肽，具有抑制单抗与II型胶原蛋白的结合反应。41 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立分析各克隆序列的结果显示，与II型胶原蛋白抗原表位序列不同，表明为其模拟抗原表位【14】。本实验室利用杂交瘤技术成功构建了一株抗RHDV的单抗，鉴定结果表明该株单抗与RHDV的衣壳蛋白VP60具有较好的反应特性。因此，该株单抗所针对的抗原表位存在于VP60的序列中。用western．blot鉴定，VP60与单抗也具有较好的反应特性(图未给出)，说明该单抗针对的表位可能为线性表位。本研究以该株单抗作为靶物质，应用噬菌体展示技术筛选R．HDV的表位。本研究中对复苏的单抗A3c细胞进行复苏，通过测定，该株单抗的亚型为IgGl，亚型的类型对单抗纯化方法的选择具有重要的意义。有资料表明辛酸．硫酸铵方法对IgG蛋白的纯化具有较好的效果【151。该实验对单抗的纯化使用了两种方法，辛酸硫酸铵方法和饱和硫酸铵两步沉淀法。结果表明辛酸硫酸铵方法具有更好的效果，其提纯的单抗回收率高、纯度高。纯度可以达到80％以上。为了进一步了解该单抗的活性及与抗原的结合特性，又测定了其效价和亲和力。结果表明该单抗具有较高的效价，为l：81920。亲和力测定结果表明单抗也具有较高的亲和力，亲和常数为k庐3．5x107。资料表明，抗体的亲和常数高于107，亲和常数高；低于101，亲和常数低【161。因此本实验纯化的单抗可以用来作为靶物质，应用噬菌体展示技术筛选抗原表位。噬菌体筛选中有多种筛选方法，比如固相载体亲和筛选、亲和珠捕获物液态筛选、固液相结合筛选等。本实验应用直接包被固相载体的方法进行亲和筛选，其优点是简便、快速。在筛选过程中，控制筛选的强度具有重要的意义。首轮筛选，为了避免特异性的噬菌体克隆被意外的筛除，筛选强度应该相对小一些，这样可以使特异的噬菌体克隆得到较好的富集。在后面的二三轮筛选中，为了使筛选的噬菌体克隆中含有更多特异性的克隆，因此需要逐步加强筛选的强度。加强筛选强度的方法有多种，比如增加洗涤液中吐温浓度，将更多的非特异性结合的噬菌体洗去；或是逐步降低靶物质的包被浓度，增加特异性噬菌体克隆的富集。本实验中使用了第一种方法，即逐步提高洗涤液中吐温浓度的办法。对于增加特异性富集，还有其它方面可以优化，比如将特异性结合靶物质的噬菌体克隆洗脱下来时不用酸性缓冲液，而是使用与靶物质特异性结合的配体。本研究未使用该方法。经过三轮亲和筛选，通过增加洗涤液的洗涤强度，特异性的噬菌体克隆得到较好的富集。对于筛选得到的噬菌体单克隆的鉴定，可以使用ELISA方法，亦可以使用western．blot方法。由于ELISA方法可以测定大量的样本，并且具有简便快速的特点，本实验中使用了ELISA方法，对筛选的噬菌体单克隆进行了鉴定。筛选的25个单克隆中有19个阳性克隆，具有很高的阳性率，也说明了噬菌体展示技术的亲和筛选使特异性的克隆得到了较好的富集。42 第一章应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位为了得到噬菌体展示肽的氨基酸序列，我们使用了碘化钠快速提取法对筛选的阳性噬菌体克隆进行了单抗DNA测序模板的提取。该方法简便、经济、快速。实验结果表明该方法成功率也很高。通过该方法，我们成功提取了阳性噬菌体克隆单链DNA测序模板，该模板送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测序结果中含有3种不同的序列。其中序列S1含有噬菌体克隆17株，说明筛选的噬菌体具有极高的纯度，该序列与抗原VP60具有极高的同源性(见表1．4)，表明该表位为一个线性表位。序列S2和S3含有的噬菌体均为1株，其氨基酸序列与抗原VP60比较，同源性并不高。但是，这两种序列中含有三个相同的氨基酸基序，并且该基序也存在于第一种氨基酸序列和VP60的氨基酸序列中，因此推测，该氨基酸基序(Ⅸ殴DP)为VP60上抗原表位的一个核心序列，其在该表位中发挥关键的作用。序列1由于与VP60的氨基酸具有极高的同源性，但是又不完全相同。因此，我们推论，序列S1(G册GMDPGVVAA)模拟了抗原RHDV的一个线性表位，其中基序(啪P)为该表位的核心氨基酸，在表位的作用中发挥重要作用。在VP60与噬菌体克隆的竞争试验中也证实了该结论。从与VP60氨基酸序列的比较中可以看出，模拟表位的序列与VP60序列的N端第25位到第38位相对应，其中核心氨基酸基序位于N端第29位到第33位。有研究表明在VP60蛋白N端的第31位到第250位氨基酸之间可能是一个主要抗原区域随1。两者之间有相互重叠的区域，而且模拟表位的核心氨基酸的大部分位于上述区域，因此，本研究在一定程度上支持了上述观点。该表位为线性的观点与ViaplanaE等【7J认为VP60蛋白的N端是线形的抗原决定簇，其在病毒感染和灭活疫苗的免疫中诱导机体产生免疫应答的观点相符。43 应用噬菌体展示技术筛选兔出曲L症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立参考文献【l】CamposSS，AlvarezM，CulebrasJM，订a1．Pathogenicmolecularmechanismsinallanimalmodeloffulminanthepaticfailure：Rabbithemorrhagicviraldisease[J]．ThejournalofLaboratoryandClinicalMedicine，2004，114(4)：215．222．【2】ArguelloVillaresJL．ViralhaemorrhagicdiseaseofrabbitS：accinationandimmuneresponse[J]．RevsciTechIntEpiz,1991，(10)：471-480．【3】张玉颖，刘光清，吴润．兔出血症病毒分子生物学研究概况【J】．动物医学进展，2006，27(3)：23．25．【4】徐为燕．兔病毒性症研究进展及国际的评价叨．南京农业大学学报，1994，3：47．52．【5】ClarkeIN，LambdenPR．Themolecularbiologyofcaliciviruses[J]．JGenVirol，1997，78(2)：291-301．【6】TorrecuadradanMJL’CoNesE，VelaC，eta1．Antigenicstructureofthecapsidproteinofrabbithemorrhagicdiseasevirus【J】．JGenVir01．1998，79(8)：1901-1909．【7】ViaplanaE，PlanaJ，VillaverdeZ．AntigenieityofVP60structuralproteinofrabbithemorrhagicdiseasevirus【J】．AichVirol，1997，I42(9)：1843—1848．【8】SmithGP,PetrenkoVA．Phagedisplay[J]．ChemRev,1997，97(2)：391—410．【9】MottiC，NuzzoM，MeolaA，eta1．RecognitionbyhumanseraandimmunogenicityofHBsAgmimotopesselectedfromanM13phagedisplaylibrary[J]．Gene，1994，146(2)：191-198．【10】PereboevaLA，PereboevaAV,MorrisGE，ela1．IdentificationofantigenicsitesonthreehepatitisCvirusproteinsusingphage-displayedpeptidelibraries[J]．MedVirol，1998，56(2)：105-111．[11】ChirinosrCL，StewardMWPartidosCD，eta1．Apeptide—mimoticantagonistofTNF—alpha-mediatedcytotoxicityidentifiedfromaphage-displayedrandompeptidelibrary[J]．Jlmmunol，I998，161(10)：5621—5626．[12】KrookM，LindblandhC．Selectionofacyclicnanopeptideinhibitortoalphachymo-trypsinusingphagedisplaypeptidelibrary[J]．MolDivers，1998，3(3)：149159．【13】BeattyJD，BeattyB．D，VlahosWCtMeasurementofmonoclonalantibodyaffinitybynon-competitiveenzymeimmunoassay[J]．JournalofImmunologicalMethods，100(1987)173-179．【14】CookAD，DavisJM，MyersMA，eta1．Mimotopesidentifiedbyphagedisplayformonoclonalantibodye2一ltotypeIIcollagen[J]．JAutoimmuno，1998，11(3)：205—211．[15】刘秀梵．单克隆抗体在农业上的应用(第1版)【M】．合肥：安徽科学技术出版社，1994：45—46．[16】林月霞，段涛．抗氯霉素单克隆抗体4D10的特性鉴定【J】．JoumalofGuangdongPharmaceuticalCollege，2010，26(4)：420-422． 第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法摘要为获得新型RHDV检测方法，本研究在亲和筛选的基础上，用筛选得到的噬茵体克隆作为模拟抗原，建立了检测兔血清中RHDV抗体的间接ELISA方法．本研究对ELISA的各个反应条件进行优化，测定该方法的特异性、灵敏性、重复性以及包被的酶标板的保存期，并用该方法检测了100份兔血清中抗体水平。实验结果表明，该方法中噬茵体的最佳包被浓度为1．56x107pfu／ml，血清的最佳稀释度为1：200，5％BSA为最适封闭液，酶标二抗的最佳稀释度为1：5000，封闭液的封闭时间、抗原抗体作用时间、酶标二抗作用时间以及底物的显色时间分别为90min、30min和10min。应用该方法检测100份兔血清中的RHDV抗体水平，其中阳性样品数为86(86％)，而用实验室建立的RHDVVP60蛋白间接ELISA方法检测，阳性样品数为73(73％)。比较两种检测方法，符合率为85％．该ELISA方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简便，适用于临床推广。间接ELISA方法的建立，为兔场免疫效果的评价和流行病学调查提供了有利工具。关键词：兔出血症病毒；噬茵体克ri-；N$i-ELISA45 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立DEVELOPMENTOFTHEINDIRECTELISAFoRDETECTIONOFANTIBODIESAGAINSTR4艿8，丁HEMoRRHAGlcDISEAsEVlRUSWITHPHAGECLON。EInordertogetanewmethodtodetectRHDV,theindirectELISAtodetecttheantibodiesagainstRHDVhadbeendevelopedwithphageclonegotfrombiopanningatthebasisofresultofbiopanning．ThereactionconditionsofELISAwereoptimized；thespecificity,sensitivity,repetitivenessandretentionperiodofELISAplatecoatedweredetected；and100serumsofrabbitweredetectedbythemethod．Theresultshowedthatthebestconcentrationofphagewas1．56x107pfu／mlandthedilutionoftheserumsamplewas1：200；5％BSAWasthebestconfiningliquid；thedilutionofHRP—goatanti—rabbitIgGWas1：5000；thereactiontimeofconfmingliquid，antigenandantibody,HRP·goatanti-rabbitIgGandsubstratewere90min，30min，30minandlOminseparately．AntibodiesagainstRHDVin100serumsofrabbitweredetectedbythemethodandthepositivesampleswere86(86％)，whichwere73(73％)bythemethodofRHDVVP60一indirectELISAdevelopedbythelaboratory．TheconcordantratebetweenthetwomethodsWas85％．IndirectELISAdevelopedinthestudyWasspecific，sensitive，reproducibleandeasilyoperateindetection，whichindicatedthatthismethodwasappropriateforapplicationinclinicaldiagnose．ThedevelopmentofindirectELISAwillsupplyafavorabletooltoevaluateimmunityeffectinrabbitryandsurveyepidemiology．KEYWORDS：Rabb#hemorrhagicdiseasevirus；phageclone；indirectELISA 第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法兔出血症(Rabbithemorrhagicdisease，IⅫD)，俗称“兔瘟”，又称兔出血热。本病是由兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasev／rus。RHDV)引起的兔的一种急性、败血性烈性传染病，以呼吸系统出血、肝坏死及实质脏器水肿、淤血及出血性变化为主要特征【l】。因该病常呈暴发性流行，发病率及死亡率极高，给养兔业带来了巨大的经济损失【2】，因此，1989年，国际兽疫局(OIC)将该病正式列为“国家动物保健编目”B类疫病，我国农业部96号令将其列为二类疫病。为了更好地诊断及防控RHD，建立一种有效的RHD抗体检测方法显得尤为重要。酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbcntAssay,ELISA)因其敏感、特异、快速且能够同时检测大量样品的特点而得到日益广泛的应用。实验室已经建立了间接兔出血症病毒VP60蛋白．ELISA抗体检测方法，由于VP60蛋白的表达需要进行细胞培养131，而噬菌体克隆的扩增成本较低，前面实验已经应用单抗A3c筛选出了能模拟RHDV抗原表位的噬菌体多肽。因此，本实验使用筛选的噬菌体克隆建立ELISA方法，并应用建立的方法检测兔血清中抗体水平。该方法的建立旨在为RHDV的抗体检测提供一种经济、特异、敏感、快速、操作简便的检测方法，为制备商品化的诊断试剂盒奠定基础，为兔出血症的检测及流行病学调查提供技术手段。l材料与方法1．1材料1．1．1试剂和血清RHDV阳性血清及阴性血清由本实验室保存；牛血清白蛋白(BSA)、明胶、酶标羊抗兔IgG(HRP-IgG)购自生物晶美公司；TMBS购I!IAmersco公司；硫酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、磷酸氢二纳、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、浓硫酸等均为分析纯试剂；待检血清100份采自江苏3个兔场。1．1．2仪器酶标仪为340n型，购flAnthos公司：微量加样器为Eppendorf公司产品；酶标反应板为美[雪ComingCostar产品；高速冷冻离心机为Eppendorf公司产品。1．2方法1．2．1应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性噬菌体克隆为展示RHDV抗原表位多肽的K1和K7，首先应用噬菌体克隆进行47 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立包被，进行ELISA实验，检测其与兔的RHDV阳性血清的结合情况。按照ELISA常规方法进行：包被两种噬菌体克隆，封闭后分别加入单抗A3c、兔的RHDV阳性血清和兔阴性血清(阴性对照)。作用后加入酶标二抗，最后显色，使用自动酶标仪测定OD450值。1．2．2间接ELISA最佳反应条件的确定1．2．2．1抗原和酶标二抗最佳工作浓度采用矩阵法【4】确定抗原与酶标二抗的工作浓度：(1)抗原噬菌体克隆K1初始浓度为2．5x10¨pfu／ml，用包被液稀释将其稀释成1x109pfu／ml，然后2倍比稀释，共8个稀释梯度。每一个稀释度加酶标板的一排，每孔100ul，4。C包被过夜。次日用PBST洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(2)然后用5％BSA封闭，每孔200ul，37。C作用2h。用PBST洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(3)将阳性和阴性血清按照1：200稀释，分别加入酶标板的孔中，每个抗原稀释度各5孔，用PBST作为空白对照，每孔100ul。37。C作用1h。用PBST洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(4)将酶标二抗(HRP．羊抗兔IgG)分别作1：5000、1：10000、1：15000、1：20000和1：25000稀释，然后分别加到酶标板中，每个稀释度加一列。其中空白对照的两列用1：10000稀释的二抗，每孔100ul，37。C作用1h。用PBST洗涤液洗板3次，每次5mill，拍干水分。(5)加入新鲜配制的TMBS．H202底物显色液，每孔100ul，避光显色5～10min。(6)加入2MH2S04终止液，每孔50ul，终止反应。(7)在酶标仪上测定450nm波长下的OD值。(8)以阳性血清OD450值接近1．0，P／N值最大时抗原的稀释倍数为抗原最佳工作浓度。该点对应的酶标二抗浓度为最佳二抗稀释度。1．2．2．2阴阳性血清最佳稀释度的确定将阴阳性血清分别作1：100、1：200、1：400和1：800倍稀释，每个稀释度加4个孔。按照ELISA操作程序进行，比较其OD450值差异。1．2．2．3封闭液和最佳封闭时间分别用1％明胶、2％明胶、4％明胶、1％BSA、2％BSA、5％BSA、2％脱脂乳、 第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出舡症病毒抗体的间接ELISA方法5％脱脂乳作为封闭液，每个封闭液作2个重复，每孔200ul，37"(2作用2h，按照确定的最佳稀释血清和酶标二抗的最佳稀释浓度进行ELISA，测定OD450值。用最佳封闭液对包被的酶标板封闭30rain、60min、90mill和120rain，进行ELISA测定，以阳性血清OD450值接近1．0，P／N值最大时为封闭的最佳时间。1．2．2．4抗原抗体最佳作用时间ELISA检测中，将抗原抗体作用时间分别调整为30min、60min、90rain和120min进行测定，其它按照最佳条件进行，测定OD450，以阳性血清OD4so值接近1．0，P／N值最大时为封闭的最佳时间。1．2．2．5酶标二抗的作用时间将酶标二抗做最佳稀释后，分别将作用时间调整为30mill、60min、90min和120rain进行ELISA测定，其它按照最佳条件进行，测定OD450，以阳性血清OD4so值接近1．0，P／N值最大时为封闭的最佳时间。1．2．2．6底物作用时间以上述经过确定的反应条件进行ELISA，加入底物后分别在室温下作用5man、10min、15mill和20min，终止反应，比较其OD450值差异。1．2．3间接ELISA操作程序的确定和结果判定以上述经过确定的ELISA反应条件作为最终间接ELISA操作程序。结果判定：参考KumISl等方法进行，采集健康非免兔血清50份，做血凝抑制试验测定RHDV抗体水平【6】，结果均为阴性。取上述血清，作1：200稀释，进行ELISA测定。这些血清数据经统计学分析，得到OD450平均值X和标准差S。根据统计学原理，OD450值拭+3S时，判为阳性；OD450值<)(+2S着判为阴性，介于二者之间着判为可疑。1．2．4阻断试验取5份RHDV阳性血清作1：50、1：100、1：200和1：400倍稀释，与等量噬菌体抗原(1．56x107pfu／m1)混合，37。C作用24h，10000rpm离心10min，取上清，与未经抗原处理的阴阳性血清一起，同时作ELISA检测，计算(N．P)／N值，若此值大于0．5，则判为阻断阳性【71。烈．P)／N=(未阻断孔OD4so值．阻断孔OD4so值)／未阻断孔OD450值49 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立1．2．5敏感性试验取RHDV灭活疫苗免疫的阳性血清5份，1：200倍比稀释至1：25600，作ELISA测定。以OD450怂0．336，且P／№2．1作为终点判定。1．2．6保存期试验按照上述ELISA确定的条件，最佳抗原包被、封闭后，分别在4"C和．20℃保存，每隔一周取出进行ELISA试验。1．2．7重复性试验取6份阳性血清在不同时间相同条件下，重复检测4次，观察OD450值的变化。1．2．8临床应用用建立的间接ELISA方法对江苏3个兔场的100份血清进行检测，计算阳性率。同时与实验室用RHDVVP60建立的ELISA比较，计算符合率。2结果2．1应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性图2．1噬菌体克隆K1与单抗和兔血清的结合活性Fig．2·1EvaluationofbindingspecificityofPhagecloneK1toMcAbandserum分别应用噬菌体克隆K1和K7包被酶标板，检测兔阳性血清的RHDV抗体水平， 第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法以抗体的稀释倍数为横坐标，OD450值为纵坐标，绘制曲线(图2．1和图2．2)。其中，以单抗A3e作为阳性对照，兔SPF血清为阴性对照。由图可以看出噬菌体克隆K1和K7均可以检测出兔血清中的抗RHDV抗体，而且它们之间的结合活性在1：100稀释时也比较高，OD450值可以达到0．8和0．6。因此，噬菌体克隆可以与兔血清中的抗RHDV多抗发生结合，即可以用噬菌体作为抗原建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。图2．2噬菌体克隆K7与单抗和兔血清的结合活性Fig．2-2EvaluationofbindingspecificityofPhagecloneK7toMcAbandserum2．2间接ELISA最佳反应条件的确定2．2．1抗原和酶标二抗最佳工作浓度将初始浓度为2．5×1011pfu／ml的抗原K1作倍比稀释后，最大稀释倍数时，二抗稀释度为1：5000时测定结果数值仍然很高(表2．1)，而当抗原1：16000时，P／N值很高，为15．792。因此，该孔对应的抗原浓度，即1．56x107pfu／ml为最佳抗原浓度，酶标二抗的最佳稀释度为1：5000。2．2．2阴阳性血清最佳稀释度的确定将阴阳性血清作1：100、l：200、1：400和1：800倍稀释进行测定，每个稀释度分别加4孔，确定阴阳性血清的最佳稀释度(表2．2)。结果表明血清在1：200稀释时，阳性血清的OD450值较高(1．283)，P／N值最大。因此，其最佳稀释度为1：200。 应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立表2．1抗原与酶标二抗不同工作浓度反应结果Table2-lReactionresultsofthephageandHRP-goatanti·rabbit]gOwithdifferentdilutions表中P为RHDV阳性m清2个平行孔的OD450平均值、N为RHDV阴性m清2个平行孔的oi：)4∞平均值PThepositiveserumOD4如averagevalueoftwodetectionholes；NThenegativeserumOD4soaveragevalueoftwodetectionholes表2．2阴阳性血清最佳稀释度的确定Table2-2Definitionofthebestdilutionofnegativeandpositiveserum表中P为RHDV阳性m清4个平行孔的OD450平均值、N为RHDV阴性JflL清4个5F行孔的OD450平均值PThepositiveserumOD450averagevalueoffourdetectionholes、NThenegativeserumOD450averagevalueoffourdetectionholes52 第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法2．2．3封闭液和最佳封闭时间以表2．3中的8种封闭液封闭酶标板进行ELISA检测，37℃作用2h。最后比较阴、阳性血清的OD450值确定最佳封闭液。结果表明，封闭液选用5％BSA效果最佳。根据最佳封闭液选择结果，选用5％BSA对酶标板进行封闭，时间调整为30min、60min、90rain和120min，进行ELISA检测。结果表明封闭液的最佳作用时间为90min(图2．3)。表2．3不同封闭液对标准阴、阳性血清检测结果的影响Table2-3Theinfluenceofnegativeandpositiveserumbydifferentconfiningliquid图2-3封闭液最佳作用时间的确定Fig．2—3Definitionofthebestreactedtimeofconfiningliquid2．2．4抗原抗体最佳作用时间将抗原抗体作用时间分别调整为30min、60min、90min和120min进行测定。结果表明抗原抗体的最佳作用时间为30min(图2．4)。 应用噬菌体展示技术筛选兔出盘症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立图2_4血清最佳反应时间的确定Fig．2-4Definitionofthebestreactedtimeofserum2。2．5酶标二抗的作用时间将酶标二抗(羊抗兔IgG)作1：5000稀释，然后将作用时间调整为30min、60min、90min和120rnin进行ELISA测定，结果表明酶标二抗的最佳作用时间为30min。(图2．5)。图2-5羊抗兔19C最佳作用时间的确定Fig．2—5Definitionofthebestreactedtimeofthegoatanti-rabbitIgG2．2．6底物作用时间加入底物后分别在37℃作用5min、10min、15min和20min终止反应，比较其OD450值差异。结果表明最佳显色时间为10min(图2．6)。 第二章应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法图2-6底物最佳作用时间的确定Fig．2—6Definitionofthebestreactiontimeofsubstrate2．3间接ELISA操作程序的确定和结果判定根据已确定的ELISA最佳条件，间接ELSIA的操作程序如下：(1)将噬菌体克隆K1稀释到1．56×101pfu／ml，包被酶标板，每孔100ul，置4。C过夜。次日用PBST洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(2)然后用5％BSA封闭，每孔200ul，37℃作用90rain，再用PBST洗涤液洗板3次，每次5rain，拍干水分。(3)加入l：200稀释的待检血清，每孔100ul，同时设立阴阳性和空白对照孔，37"C作用30rain，再用PBST洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(4)加入1：5000稀释的酶标羊抗兔kG100u吼，37"C作用30min，再用PBST洗涤液洗板3次，每次5min，拍干水分。(5)加入新鲜配制的TMBS．H202底物显色液，每孔100ul，室温避光显色10min。(6)加入2MH2S04终止液，每孔50ul，终止反应。(7)在酶标仪上测定450nm波长下的OD值。应用上述ELISA方法，测定50份阴性血清。结果表明，50份阴性血清的OD450值最高为0．277，最低为0．109，平均值(X)为0．174，标准差(SD)为0．054，临界值X+3SD=0．336，XI+2SD=0．217。据此，确定血清样品OD450值之O．336，且ⅣN≥2．1，方可判为阳性；OD450值50．217，P／N<1．5判为阴性；OD450值介于二者之间，1．5
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