人胰岛细胞分离纯化的实验研究

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1、第一军医大学硕士学位论文人胰岛细胞分离纯化的实验研究姓名：赵德明申请学位级别：硕士专业：内分泌与代谢指导教师：蔡德鸿20030601缩略词表ABBREⅥATIoNINDEX人胰岛细胞分离纯化的实验研究摘要研究背景：胰岛细胞移植是一种非常有前景的治愈糖尿病的手段。虽然既往已经在实验动物模型中成功的根治了糖尿病，但是在临床应用上仍有很多问题需要解决。近年来随着Edmonton方案取得了鼓舞人心的成功，为用胰岛细胞移植的方法治愈1型糖尿病开拓了广泛的应用前景。但是仍有很多问题有待进一步解决，如移植的胰岛细胞需要有足够高的活性才能逆转高血

2、糖状态、移植的胰岛细胞需要足够多的数量、排斥反应、受者再次出现自身免疫反应、简便经济的新方法等等。鉴于在免疫抑制剂、器官获取技术、胰岛细胞分离技术和胶原酶方面取得的进展，我们有理由相信胰岛细胞移植将成为治疗1型糖尿病的最佳选择之一。本实验旨在探讨用常见试剂进行人胰岛细胞的分离与纯化，并利用分离纯化所得到的胰岛细胞进一步研究新型免疫抑制剂对胰岛细胞功能的影响。目的：l、用两步消化法和试管纯化法初步建立用胶原酶P分离、纯化人胰岛细胞的方法；2、了解Pcfabloc和PNGS对胰岛细胞分离纯化的最终产量和胰岛细胞功能的影响；3、用M2T

3、法体外探讨三种不同免疫抑制剂对所分离纯化的胰岛细胞活力的影响。方法：l、胰岛细胞的分离纯化：按本实验室建立的方法，用胶原酶P两步法消化分离胰腺，用试管法通过不连续密度梯度HC-A-Fiooll纯化一2．液纯化胰岛细胞。2、通过DTZ染色，在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度，用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。3、通过免疫组化和透射电镜观察分离纯化的胰岛细胞是否存在胰岛素和胰高血糖素颗粒。4、通过DTZ染色，在倒置显微镜下计数Pefabloc组和PNGS组纯化胰岛细胞的数量，用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。5、采用MTF法测

4、定三种免疫抑制剂在不同浓度作用下胰岛细胞括力的变化。结果：1、纯化后平均每个胰腺可获得81444±34631个胰岛细胞团，平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团1136±474，平均纯度为74．84％。2、纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好，高糖时胰岛素的释放量为低糖时2．15的倍(p<0．01)，免疫组织化学和透射电镜下胰岛素和胰高血糖素颗粒均为阳性。3、胶原酶P工作液中加入Pefabloc后，每个胰腺可获得110250-t-28590个胰岛细胞团，平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团1559±319个，产量高于Control组，有

5、显著意义，但对胰岛素释放刺激反应无明显差别，S1分别为Pefabloc组1．93±0．2l和Control组1．86±0．19；纯化液中加入PNGS后，每个胰腺可获得65750±8132个胰岛细胞团，平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团871±204个，产量高于Control组，但统计学上没有显著差别，胰岛素释放刺激反应结果显示，s1分别为PNGS组2．74±O．54和Control组1．86±0．19，PNGS组明显高于Control组，差别显著。4、低剂量的雷帕霉素对胰岛细胞活力无明显影响，lng／mL及以上雷帕霉素能引起胰岛细胞

6、活力降低，低剂量和高剂量的daclizumab和FTY?20对胰岛细胞的活力均无明显影响。结论：l、建立了人胰岛细胞分离纯化的方法。2、Pefabloe能增加胰岛细胞的产量，PNGS可以保护胰岛细胞。3、雷帕霉素对胰岛细胞有一定的毒性作用，daclizumab和FTY720对胰岛细胞无明显毒性作用。关键词：胰岛；分离；纯化；Pefabloc；三七总皂甙；免疫抑制剂：噻唑蓝一1．Theexperimentalstudyontheisolationandpurificationoftheisletcellsfromhumanpancr

7、eataAbstractBackgroundIslettransplantationhasthepotentialtocurediabetesmellitus．Neverthelessdespitesuccessfulreversalofdiabetesinmanysmallanimalmodels，theclinicalsituationhasbeenfarmorechallenging．Newhopeforthetreatmentoftype1diabeteshasrecentlyemergedfromtheencouragi

8、ngresultsofisletcellIransplantationinhumansknownas“nleEdmontonProtocol”duringthelastfewyears．HowevertheSUCCESSofclinicaltria