FLO1基因内部重复序列变化对酿酒酵母絮凝蛋白功能的影响

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1、中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences硕士学位论文作者姓名：量鳖指导教师：值羞莲巫宜虽学位类别：垄堂亟±学科专业：遗佳堂研究所：2013年5月●’’‘●一·■■儿occulininSaccharomvcescerevtslaeBy—FengYueAThesisSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofPhilosophy

2、InstitutionofMicrobiologyMay,2013Ⅲ4眦2眦7¨叭¨¨¨¨叭■■__■m8叭3㈣2洲Y学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体己经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书己使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均己在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本人愿承担一切责任。学位论文作者签名：岳峪仞I；年歹月

3、词日学位论文使用授权声明本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。同意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有；本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)作者签名：导师签名：日期：训)年孓月7孑日日期：却岁年J～月彩日摘要絮凝的发生依赖于酵母细胞表面絮凝蛋白与邻近细胞表面寡聚甘露糖

4、链的相互结合，Flolp是非常典型的絮凝蛋白，由FL01基因编码，该基因中间存在着大量的衔接重复序列，根据编码氨基酸序列的不同，可将这些重复序列分为A、B、C和D四个重复单元。高度重复序列是絮凝基因中非常活跃的成分，它们通过在DNA复制过程中驱动基因内部或基因之间的滑移和重组，导致不断产生新的FLO基因或假基因，结果一方面可能产生絮凝表型的多样性，同时也存在着表型不稳定的严重问题。已有研究发现重复序列单元A拷贝数的改变会导致细胞絮凝能力、絮凝类型的变化、甚至使酵母细胞呈现黏附、生物膜等多种表型。本课题组对FL01内其他三个重复序列单元B、

5、C和D分别进行了研究，结果表明，重复单元B、C或D分别缺失后，细胞絮凝特性受甘露糖抑制的敏感性降低；同时对环境pH的改变具有更广泛的适应性。利用将絮凝蛋白与GFP蛋白融合表达的方式，发现FL01基因内重复序列单元c全部缺失增强了絮凝蛋白在环境酸碱变化中的构象稳定性，从而提高了酵母菌絮凝特性对环境酸碱变化的适应性。预示着衔接重复序列对絮凝蛋白的结构和功能具有重要的调控作用。为了进一步研究衔接重复序列对絮凝蛋白功能的影响，以及蛋白功能变化的结构生物学基础，为构建遗传稳定的最小絮凝功能基因奠定理论基础，本研究在已有工作基础上，开展了如下研究工作

6、：以完整絮凝基因FL01为模板，通过融合PCR的方法构建了重复序列单元C不同程度缺失的衍生基因，并在非絮凝型酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达，对不同酵母菌株絮凝能力测定结果表明，酵母絮凝对甘露糖浓度及pH的敏感性与重复序列单元C的拷贝数有关，重复序列数量越多越敏感。进一步确证了FL01内重复序列单元C全部缺失后对絮凝蛋白功能及酵母菌絮凝特性的影响。通过融合PCR的方法得到FL01内靠近3’端重复序列单元B、C和D全部缺失的衍生基因FLOlbcd，比较FL01及FLOlbcd在非絮凝酵母细胞中的表达水平及絮凝特

7、性差异，发现与表达完整絮凝基因FL01的酵母菌株YSFl相比，FL01内靠近3’端重复序列单元全部缺失的酵母菌株YSFlbcd的絮凝强度仅略有降低，而且其絮凝特性对钙离子的依赖性、金属离子的敏感性及乙醇敏感性均没FL01基因内部重复序列对絮凝蛋白结构和功能的影响有明显变化，但对环境pH以及温度的变化表现出更广泛的适应性，受甘露糖抑制的敏感性也有所降低。FL01中重复序列单元B、C和D全部缺失与单独缺失C或D一样可以提高絮凝蛋白的功能稳定性，使酵母细胞在极端酸碱环境下仍然表现出明显的絮凝特性；这些重复序列的完全缺失对其他絮凝特性没有明显影响

8、。因此可以通过重复序列删减策略构建遗传稳定的最小絮凝功能基因，为絮凝特性在发酵工业及环境修复方面的可控应用奠定理论基础。为了能从结构生物学角度阐明FL01内衔接重复序列变化对絮凝蛋白功能的影响