生理生化试验

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1、荧光定量PCR技术及其在科研中的应用孙冲南京林业大学森环学院江苏南京210037[摘要]荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术，与常规的PCR相比，荧光定量PCR具有检测灵敏，精确，特异性强，无污染，快速等特点。自问世以来在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域应用较为广泛。在植物研究方面应用较少。现已开始用于植物基因表达分析、外源基因基因鉴定等方面的研究。本文介绍了实时荧光定量PCR技术的原理、试验方法、优缺点，并对其在植物研究中的应用及前景作了探讨。[关键词]实时荧光定量PCR技术；原理；植物；检测；应用；聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PC

2、R）技术是1985年开始出现的一项基因检测技术。由于PCR技术简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究，成为分子生物学必不可少的研究工具。由于传统的PCR技术存在，不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其应用受到局限。实时荧光定量PCR技术是在PCR基础上发展起来的，将核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测等技术融合在一起的一项创造性技术。自产生以来，在医学、检疫、国防军事及农业等各个领域得到了广泛应用。该技术带来了方法学上的重要突破，在植物学研究中具有广阔的应用前景。1.实时荧光定量PCR技术的概念及基本原理实时荧光定量PCR技术（Realtimefluore

3、scentquantitativePCR，Real-timeQ-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个—Ct值(Thresholdcycle)概念，Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平

4、均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R2＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量[1,2]。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。2.实时荧光定量PCR技术的实验方法2.1RT-PCR以RNA为起始实验材料。分为两种：（1）onestep法，反转录反应和PCR反应在同一反

5、应管中进行。操作简单、反应连续、污染几率低，适合于病原体的检测。（2）twostep法，反转录反应和PCR反应分两步进行，反转录反应液（cDNA）作为PCR反应的模板，适合于mRNA表达量的解析。2.2PCR以DNA为起始实验材料。3.实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种，分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。但在植物中常用的检测模式主要有两种：荧光染料检测和荧光水解探针检测。3.1双链DNA结合染料SYBRGreenI技术SYBRGreenI是一种替代溴化乙锭能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发

6、波长的染料，它只有与ds-DNA结合后才会发出荧光。当DNA解链成为单链时，它从链上释放出来，这时荧光信号急剧减落。因此，荧光强度可以代表扩增产物的数量。其最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBRGreenI结合到双链DNA后，荧光强度大大增加，具有较强的敏感性，且不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，操作简便，且价格相对较低，故广泛应用于实时定量PCR研究中。但由于SYBRGreenI非特异结合双链DNA，引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过升高温度后测量荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由溶解曲线分析

7、产物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量结果。此外，设计引物时避免引物二聚体的出现，在PCR过程中建立不加模板的阴性对照，在试验结束后，进行凝胶电泳分析等方法的实施可以有效保证试验结果的可靠性。3.2荧光探针检测技术根据标记基团的荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）原理而实现的[3]。该技术是在探针的5'端标记R基因，3'端标记Q基因，当两者距