PTEN在纤维化肝组织中的动态表达及其对肝星状细胞增殖与凋亡的影响

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1、中文摘要PTEN在纤维化肝组织中的动态表达及其对肝星状细胞增殖与凋亡的影响摘要肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是各种不同致病因子引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径，是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应。其主要病理改变是细胞外间质(extracellularmatrix，ECM)的过度合成与异常沉积。肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)是参与该过程的最重要细胞，它的激活导致自身增殖和胶原合成增加被认为是肝纤维化形成的中心环节，而肝纤维化恢复期HSC凋亡明显增多。因此，抑制HSC活化、增殖或诱导其凋亡是逆转肝纤

2、维化的关键所在。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基[霾(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosomeTen，PTEN)是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，可负性调控肿瘤细胞细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来，对PTEN的研究己从肿瘤领域逐渐延伸至非肿瘤领域。研究表明，在特发性肺纤维化患者的肺组织中，成纤维细胞的PTEN表达及其磷酸酶活力都低于正常肺成纤维细胞；并且其过表达或激活可抑制体外肺成纤维细胞增殖、诱导其凋亡。在有关PTEN与心肌

3、纤维化的研究中也显示PTEN基因敲除的小鼠心脏与体重之比增加、心肌纤维化程度明显、心肌收缩性降低。这提示PTEN的低表达或失活参与了特发性肺纤维化及．心肌纤维化的发生。而在PTEN与某些肝脏疾病的研究中，有研究发现特异性肝细胞PTEN缺失不仅可引起肝细胞癌而且还导致与肝纤维化密切相关的非酒精性脂肪性肝炎的发生。但迄今为止，PTEN在肝纤维化中的表达及作用，特别是对HSC增殖及凋亡的影响仍不清楚。为此，本研究应用胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型，探讨PTEN在肝纤维化过程中的动态表达及其与在体HSC增殖、凋亡的关系；并进一步将携带野生型PTEN基因及其突变体G

4、129E基因的重组腺病毒转染体外培养的活化HSC，观察过表达的PTEN对活化HSC增殖、凋亡及细胞周期中文摘要的影响，同时探讨PTEN调控活化HSC增殖、凋亡及细胞周期的信号转导机制，旨在为深入揭示肝纤维化的病理生理机制，寻求有效预防和治疗肝纤维的新策略提供实验依据。实验内容主要包括以下四部分：第一部分PTEN在大鼠纤维化肝组织中的动态表达及其与在体肝星状细胞增殖、凋亡的关系目的：研究大鼠肝纤维化过程中肝组织的PTEN动态表达及其与在体HSC增殖、凋亡的关系。方法：胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型，HE、Masson三色染色观察肝脏病理组织学变化，免疫组织化

5、学染色检测大鼠肝组织中PTEN及仅．平滑肌肌动蛋白(alpha．smoothmuscleactin，a．SMA)的分布；免疫荧光双标记共聚焦激光扫描显微镜技术测定大鼠肝组织中活化HSC的PTEN表达；末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(TUNEL)及0【．SMA免疫组织化学双染检测在体活化HSC的凋亡；Westernblot和Real．timeQ．PCR检测大鼠肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达。结果：@HE及Masson三色染色显示，胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型成功建立，随着造模时间延长肝纤维化程度逐渐加重。在造模不同时间均可见不同程度的肝细胞变性坏

6、死而导致正常肝细胞逐渐减少。②0【．SMA免疫组织化学染色显示，正常大鼠肝组织中仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达；随着肝纤维化的发展，大鼠肝组织中0【．SMA阳性细胞逐渐增多，造模1wk、2wk、3wk及4wk不同时间大鼠肝组织0c．SMA的阳性光密度值(O．16±0．01，0．17±0．01，0．214-0．01，O．26±O．02)均显著高于假手术组(O．07±O．01)，P<0．01；且各组之间均有明显差异(尸

7、，活化HSC与凋亡HSC共存。造模1wk、2wk、3wk及4wk不同时间大鼠肝组织HSC凋亡指数分别为4．57％±O．41％、4．02％±O．48％、3．45％±O．37％、2．88％±O．50％，即随着肝纤维化程度加重，活化HSC凋亡指数逐渐减少(P