人GAD65+DNA疫苗对NOD鼠糖尿病的预防作用及机制探讨

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1、人GAD65DNA疫苗对NOD鼠糖尿病的预防作用及机制探讨中文摘要第一部分DNA疫苗的构建与鉴定目的构建1型糖尿病自身抗原谷氨酸脱羧酶(GAD)65及胰岛素原(Proinsulin)的DNA疫苗，并对其表达产物进行鉴定。方法从人胰腺eDNA文库用半巢式PCR扩增出编码GAD65、Proinsulin的eDNA，克隆入载体PGEM—T中，再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1(+)中，构建重组载体pcDNA3．1(+)／GAD65、pcDNA3．1(+)／Proinsulin。测序后在真核细胞COS一7中进行体外短暂表达，Western印迹法对其表达产物进行鉴定，用RT—PeR方

2、法鉴定人GAD65DNA疫苗在NOD小鼠体内的表达。结果克隆的人GAD65基因，测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同，仅在第190位氨基酸有一TTA(Leu)一CTA(Leu)的同义突变：人Proinsulin基因与Genbank公布的序列基本相同，仅在第63位氨基酸(c肽区)有一CAG(Glu)一cGG(Arg)的突变；Western免疫印迹法证实两种DNA疫苗在COS一7细胞中有效地获得了表达；小鼠肌肉内人GAD65基因表达在第l天时较弱，第4天时最明显，第7天时趋于减弱i斗7，结论运用基因克隆方法构建的人GAD65、ProinsulinDNA疫苗，均能在真

3、核细胞内有效地表达重组抗原；人6AD65DNA疫苗免疫NOD鼠后在其体内能检测到GAD65重组抗原的有效表达。该疫苗的构建成功，为l型糖尿病(T1嗍)的免疫干预提供了实验基础。关键词DNA疫苗，分子克隆，谷氨酸脱羧酶，胰岛素原，1型糖尿病第二部分人GAD65DNA疫苗对NOD鼠糖尿病和胰岛炎的预防作用目的探讨人GAD65DNA疫苗对NOD小鼠糖尿病和胰岛炎的预防作用。f方法4周龄NOD雌鼠随机分为PBS(n=21)、PcDNA(n-20)、GAD65(n=21)、、Pins(n=21)、G+I(n=21)五组。小鼠胫前肌分别注射PBS、质粒PcDNA3．1、人GAD65DNA疫苗、

4、人ProinsulinDNA疫苗、人GAD65DNA疫苗+人ProinsulinDNA疫苗，注射量为50ug，一周后重复一次，两次共100ug。自10周龄始，每周测尿糖一次。尿糖阳性后测血糖，连续2次血糖≥16，7mmol／L，即诊断为糖尿病，观察30周龄的累积发病率。各组取12周龄未发病NOD鼠(n=10)胰腺做HE染色观察胰岛炎，用TUNEL+SABC法检测胰岛B细胞凋亡情况。‘结果(1)30周龄时，PBS、PcDNA、GAD65、Pins、G+I五组累计发病率分别为95，2％、80．o％、61．9％、76．2％、76．2％。与PBS组比较，GAD65组发病率明显降低(P=0．

5、008)；与PcDNA组比较，GAD65组发病率下降了18．1％。(2)12周龄时GAD65组胰岛炎平均积分低于PBS组(P=O．002)和PcDNA组(P=O．047)。(3)GAD65组胰岛p细胞凋亡率显著低于PBS组(P=O．014)和PcDNA组P=O．023)0／j结论人GAD65DNA疫苗能减轻NOD小鼠胰岛炎，降低胰岛B细胞凋亡，在一定程度上预防NOD小鼠发生自身免疫性糖尿病。关键词DNA疫苗，胰岛炎．谷氨酸脱羧酶，1型糖尿病。非肥胖糖尿病鼠，凋亡Il第三部分人GAD65DNA疫苗对NOD鼠Thl／Th2平衡的影响目的探讨ThlFrh2免疫偏移在人GAD65DNA疫苗

6、预防NOD小鼠胰岛炎和糖尿病中的作用。方法各组取12周龄的NOD鼠10只，处死后取脾制成脾细胞悬液，培养72小时，MTT法检测脾细胞刺激指数(SI)、ELISA法测定血清、脾细胞培养上清Thl细胞因子IFN．Y和Th2细胞因子IL．4水平；从脾脏内抽提总RNA后以RT-PCR半定量检测脾脏细胞因子IL一4、IFN．YmRNA和核因子NF—ATc、NF—ATpmRNA表达水平。结果(1)GAD65组血清IL一4水平、脾脏IL一4、NF—ATcmRNA表达水平显著性高于PBS组和PcDNA组；(2)GAD65组脾脏内NF—ATpmRNA表达水平显著性低于PBS组。(3)血清、脾上清IF

7、N—Y水平及脾脏IFN-YmRNA表达水平五组间无显著性差异。(4)GAD65组刺激指数比PBS组、PcDNA组低但均无显著性差异。(5)GAD65组血清、脾脏IL一4／IFN—Y比值水平高于PBS组与PcDNA组，但均无显著性差异。结论人GAD65DNA疫苗通过上调NF-ATc、IL一4mRNA和下调NF．ATpmRNA，从而使Th2细胞因子IL一4水平上升，免疫平衡向Th2偏移，致使NOD鼠胰岛炎减轻，胰岛B细胞凋亡减少而预防NOD鼠发生糖尿病。关键词谷氨酸脱羧酶