普鲁兰酶逆向合成麦芽糖基-α-甜环糊精

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1、FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES普鲁兰酶逆向合成麦芽糖基-环糊精张永伟，徐学明，赵建伟，王金鹏，金征宇(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)摘要以麦芽糖和Ot一环糊精作为底物，利用普鲁兰酶逆向合成作用合成了麦芽糖基一d一环糊精。用薄层色谱、液一质联用对产物进行了鉴定，并用薄层色谱对其分离。对影响麦芽糖基一一环糊精合成的反应物摩尔比(麦芽糖／a一环糊精)、底物浓度、反应温度、反应时间、加酶量、pH等因素分别做了单因素实验，最终确定了反应条件：反应物摩尔比(麦芽糖／or一

2、环糊精)为16：1，反应时间24h，反应温度为58℃，加酶量400U／gd一环糊精，pH4．5。关键词麦芽糖一一环糊精，麦芽糖，d一环糊精，普鲁兰酶环糊精在食品、医药化妆品、分析化学等领域被1材料与方法广泛应用。但是，母体环糊精一般溶解性较小，具有一定毒性，这就大大限制了其应用范围I3。分支环1．1材料与试剂糊精是环糊精的衍生物，在环糊精分子的羟基上连有普鲁兰酶，无锡杰能科公司；普鲁兰、麦芽糖-一单糖或多糖的残基，这样可以扩大母体环糊精的亲水环糊精，日本WAKO公司；所有化学试剂均为分析纯性，改善其溶解性。近些年，对天

3、然环糊精进行糖(AR)；薄层层析硅胶(GF254)，青岛海洋化工有限基的侧链修饰的科研工作在国外得到重视并取得进公司。展，但国内才刚刚起步。1．2仪器麦芽糖基一o【一环糊精(Mal—oL—cycyclodextrin)是仪-101A2型干燥箱，上海市实验仪器总厂；JB．3型环糊精在其葡萄糖残基的第6位碳原子的羟基上偶磁力搅拌机，上海雷磁新径仪器有限公司；恒温水浴联1个麦芽糖残基的分支环糊精。其在水中溶解度锅，上海市实验仪器总厂；Waters600高效液相色谱为43g／(100mL)，且无任何毒性与溶血性，如果能仪；紫外

4、检测器LichrospherNH2(2．1×250mm)，实现产业化生产，将对食品、医药等行业产生巨大影Waters公司；质谱仪WatersPlatformZMD4000，Wa-响。麦芽糖基．．环糊精的合成与应用研究国外有过ters公司。报道-6]，Naomi等人用麦芽糖基-一环糊精与Caco一21．3方法细胞建立模型，突出了麦芽糖基一．环糊精的无毒1．3．1酶活力的测定性E73。Fukaya等人用麦芽糖基一一环糊精包合一种治酶活力单位定义：特定条件下(pH4．5，50疗哮喘的药物，包合后药物利用率是原来的数十℃)，从

5、普鲁兰底物每分钟释放相当于葡萄糖的1个倍J，但是麦芽糖基一一环糊精相关研究在国内尚未还原当量所需的酶量为1个酶活力单位(u)。测定方法：1mL原酶液用50mmol的乙酸一乙酸见过相关报道。钠缓冲液稀释至1000倍，取0．2mL酶液与0．8mL本课题组采用酶法合成麦芽糖基一-环糊精，并质量分数0．5％的普鲁兰缓冲液，在50℃下反应5对其进行了简单的分离和结构鉴定，同时对影响产物min，以Smogyi—Nelson比色法测还原糖m。产量的各因素进行了研究，填补了国内麦芽糖基一0【一最终测定的酶活为452U／mL。环糊精合成

6、研究的空白，为解决技术壁垒及国内进行麦芽糖基一．环糊精合成研究提供数据参考。1．3．2麦芽糖基．仅一环糊精得率计算第一作者：硕士(金征宇教授为通讯作者)。得率／％=蒜慧。国际科技合作项目(2007DFA31120)，江苏省自然科学基金创新1．3．3麦芽糖基．．环糊精合成学者攀登项目(BK2008003)，食品科学与技术国家重点实验室利用麦芽糖和d一环糊精作为底物，以普鲁兰酶2008年度目标导向项目(SKLF—MB一200804)收稿日期：2009—02—05，改回13期：2009—04一O8作为催化剂在一定条件下逆向反

7、应合成Mal--CD。1．3．4麦芽糖基．一环糊精的鉴定46lQ!：曼曼：鱼(!!旦!曼曼对1．3．3合成的反应产物进行100℃灭酶15l296．3lo0rain，然后稀释10倍，10000r／min离心30rain，洗脱、浓缩、冷冻干燥得产品。用0．45m微滤膜过滤，采用液质联用进行对冻干产品定性，采用ESI一离子方％1297．8式，离子源温度为100℃，脱溶剂温度250℃，质量范1295．4l298．7围200—1500m／z。O605．6。}、f==~1533．92结果与分析5(x】l0D0l5002．1检测条件

8、的建立图2反应产物负离子质谱图经过反复的实验，确定液质联用检测条件为：流动相(乙腈)：(水)=52：48，流速0．3mL／min，柱温35℃，进样量为15L，标准品反应产物的液质联用图谱如图1所示。麦芽糖基-．环糊精标准品在0i“_ll—4．24rain处出峰，样品在4．25rain处出峰，出峰时间基本一致。对4．25rain出峰