枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶活性检测新方法的建立及该酶的底物偏好性研究(1)

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1、分类号：Ｒ２７学校代码：１０６９７密级：公开学号：２０１５２０９１５５硕士学位论文’ＭＡＳＴＥＲＳＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶活性检测新方法的建立及该酶的底物偏好性研究学科名称：中药药物化学作者：刘慧指导老师：高文运教授西北大学学位评定委员会二〇一八年摘要摘要乙酰羟酸合酶(Acetohydroxyacidsynthase,AHAS)是催化生物体内异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸这三种必需支链氨基酸合成的第一步反应的限速酶。由于支链氨基酸只能在细菌、真菌、藻类及高等植物体内合成，而动物及人自身无法

2、完成这些化合物的合成，必需从食物中获取，所以常常以支链氨基酸合成途径中的关键酶为靶标筛选抗菌药物和除草剂。乙酰乳酸合酶（Acetolactatesynthase,ALS）是微生物体内异丁醇代谢途径中的关键酶，它对调控异丁醇代谢途径有重要意义。因此，为了揭示AHAS/ALS的功能和催化机制，建立有效的AHAS/ALS活性测定方法就显得尤为重要。目前测定AHAS/ALS活性方法主要有GC法和UV法。但是这些方法由于自身的一些缺点，不能完全满足分析需求，所以仍需要建立新的分析方法。本文以1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯（DMB）为衍生化试剂，建立了简

3、单便捷的柱前衍生HPLC法来测定枯草芽孢杆菌源ALS的活性以及其底物偏好性。酮酸（丙酮酸和丁酮酸）及邻二酮（丁二酮及2,3-戊二酮）的衍生化条件为：DMB过量（与酮酸和邻二酮摩尔比≧10：1），80℃反应1h；HPLC检测条件：ODS色谱柱（2504.6mm,5m），乙腈：水=35%：65%等度洗脱，洗脱的时间为25min，检测波长为364nm。以DMB为衍生化试剂检测丙酮酸钠、2-丁酮酸、2,3-丁二酮和2,3-戊二酮时，丙酮酸钠在0.02-1.0mM的范围内检测，线性良好，线性方程为y=15384x345.4，R2=0.993；2-丁酮酸

4、在0.02-0.8mM的范围线性良好，线性方程为y=3423x118.5，R2=0.995；2,3-丁二酮0.02-1mM的范围内检测，线性良好，线性方程为y=3344x6.886，R2=0.997；2,3-戊二酮0.02-1mM的范围内检测，线性良好，线性方程为y=1259x30.93，R2=0.998。以上述实验结果为基础，建立了简单高效的柱前衍生HPLC法测定ALS的活性。这个方法不仅可以用于仅丙酮酸作为单底物时ALS活性的测定，也可以用于丙酮酸及丁酮酸作为双底物时ALS活性的测定；同时，该方法还可以从底物的消耗量和产物生成量两个角度来

5、评价ALS的活性。利用新建立的方法，我们不仅测定了ALS的稳态动力学参数（单底物及双底物），而且还着重探讨了ALS在催化丙酮酸与丁酮酸的双底物反应时的底物偏好性。本论文中建立的DMB柱前衍生-HPLC法测定ALS活性的方法简单易行、准确可靠，并可以进一步扩展到ALS底物偏好性的研究，为深入探讨ALS的催化机制打下I西北大学硕士论文了良好的基础。关键词：乙酰羟酸合酶（AHAS），乙酰乳酸合酶（ALS），1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯（DMB），衍生化反应，底物偏好性IIAbstractAbstractAcetohydroxyacidsyntha

6、se(AHAS)isoneoftherate-limitingenzymesthatcatalyzethesynthesisofthethreeessentialbranched-chainaminoacidsincludingisoleucine,leucine,andvalineinvariousorganisms.Sincebranched-chainaminoacidscanonlybebiosynthesizedinbacteria,fungi,algae,andhigherplants,butnotinanimalsandhumanbo

7、dies,peoplehavetoobtaintheseessentialconstituentsfromfoods.Therefore,AHAShasbeenregardedasapotentialtargetfordevelopingnovelherbicidesandantimicrobialagents.Acetolactatesynthase(ALS)isakeyenzymethatcatalyzesthesynthesisofinisobutanolbiosyntheticpathwayofmicroorganisms,anditiso

8、fgreatsignificancefortheregulationofisobutanolmetabolicpathwa