马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究

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1、：一：：．．．：：讀：清分类号：S852.65单位代码：10183研究生学号：2014851009密级：公开研吉林大学博士学位论文马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究ConstructionandImmunologicalStudyofVLPsandRecombinantRABVExpressingGlycoproteinofMARV作者姓名：盖微微专业：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：夏咸柱研究员培养单位：动物医学学院2018年6月本研究由国家自然科学基金（31402173），国家重点研究发展计

2、划（2016YFD0501003,2017YFD0501804）和国家科技部国家科技重大专项（2015ZX09102025,2014ZX09102044-007）资助ThisworkwassuppotedbytheNationalNaturalSciencesFoundationofChina(No.31402173),theNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(2016YFD0501003,2017YFD0501804)andtheNationalScienceandTechnologyM

3、ajorProjectoftheMinistryofScienceandTechnologyofChina(No.2015ZX09102025and2014ZX09102044-007).中文摘要马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究马尔堡出血热（MHF）是由马尔堡病毒（MARV）引起的一种急性、烈性出血性人兽共患传染病，目前尚无有效的疫苗和治疗药物。此外，由于MARV属于生物安全四级病原体，进一步阻碍了其传统疫苗的研发。因此，研制安全、有效的新型疫苗对于应对MHF的暴发流行和可能的生物恐怖袭击均具有重要意义。病

4、毒样颗粒（VLPs）不含病毒核酸，无感染或复制能力，安全性高，形态结构与天然病毒相似，可诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答反应，是当前基因工程疫苗研究的热点。基于VLP制备的乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头状瘤病毒（HPV）等多种新型疫苗均已成功上市。近年来，随着研究的深入，病毒载体疫苗在烈性传染病的防控中发挥着重要作用。狂犬病病毒（RABV）作为疫苗载体具有基因组简单、可稳定表达外源蛋白、允许插入多个大片段的外源基因且并不影响病毒自身复制、病毒基因组不会整合到宿主基因组等优点。本论文利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac/IC）

5、构建并制备MARVVLPs，同时以狂犬病病毒SRV9株为载体，构建表达MARVGP的重组狂犬病病毒，分别以小鼠、马和非人灵长类等动物评价其安全性和免疫原性，为研制安全、高效的MARV新型疫苗奠定基础。利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建表达MARV糖蛋白（GP）和基质蛋白（VP40）的重组杆状病毒，基因组PCR、间接免疫荧光和WesternBlot等方法鉴定结果表明：拯救的重组杆状病毒可成功表达MARVGP和VP40蛋白。将获得的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞成功获得了MARVVLPs，透射电镜观察表I明：VLPs与MARV天然结构相似，具有典型的丝

6、状结构，大小约为600-1000nm。利用超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心等方法纯化MARVVLPs，辅以（单独或联合使用）佐剂（茯苓多糖［PCP-II］、聚肌胞苷［PloyI/C］和铝胶［Alum］）制备免疫原，以小鼠和猴评价其免疫效果。小鼠试验结果表明：MARVVLPs成功诱导小鼠机体产生特异性中和抗体和细胞免疫应答。3种免疫佐剂中PCP-II的效果明显优于其他组，可诱导机体产生显著高的抗MARV抗体、B淋巴细胞、T淋巴细胞和细胞因子分泌。猴试验结果显示：MARVVLPs免疫恒河猴后可刺激机体产生抗MARV抗体，ELISA抗体效价可达1：1280，病

7、毒中和抗体效价可达1：320。MARVVLPs免疫组恒河猴的外周血淋巴细胞（PBMCs）可分泌显著增多的IFN-γTh1型细胞因子和IL-4Th2型细胞因子。以上结果表明，MARVVLPs联合PCP-II佐剂在对小鼠和恒河猴具有良好的免疫效果，可诱导机体产生特异性体液免疫应答与细胞免疫应答。抗血清疗法是治疗病毒和细菌等感染的快速、经济和有效手段，将纯化的MARVVLP辅以佐剂免疫健康马匹，成功制备了马抗MARV高免血清和精制免疫球蛋白F(ab')2。马抗MARV高免血清的ELISA抗体效价可达1：20480，中和抗体效价可达1：640；马抗MARV

8、IgG和精制免疫球蛋白F(ab')2对MARV假病毒的半数效应浓度（EC50）分别为0.316mg/mL和10mg/mL。