《层析分离纯化技术》PPT课件

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1、层析分离纯化技术内容提要1、层析原理与操作2、蛋白质纯化策略生命科学与生物技术生物分离技术基因重组技术免疫检测技术从基因组到蛋白质从有限到无限离心沉淀电泳层析层析原理与操作层析的起源和原理起源----1906年，俄国植物学家Tsweet原理----利用物质分配系数不同达到分离目的原理与操作Chromatography层析色谱什么是生物层析根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX大小与形状

2、：size/mass(diffusion,sedimentation)GF结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC这些特性的区别使不同分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作层析技术IonExchange(IEX)－离子交换电荷–可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化SizeExclusion(SEC)－分子筛（或凝胶过滤）分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化Affinity(AC)－亲和生物相互作用–用于复杂样品的最早捕获或

3、中间纯化HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水和反相疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖CeramicHydroxyapatite(CHT)&CeramicFluoroapatite(CFT)－羟基磷灰石独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化原理与操作液相层析最广泛的蛋白质分离纯化方法条件温和维持蛋白质空间结构与活性基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离原理与操作层析的5个操作步骤装柱

4、并平衡上样平衡洗脱再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作层析图原理与操作第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量(A280),由UV检测器读出，y轴基线洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉有时这里也显示梯度浓度等检测值时间或体积，x轴DuoFLow软件系统非常直观，易学简单明快，4个步骤进入操作：BrowserSetupProtocolRun观察样品情况,调节色普图和峰高度orGoDoSomethingElse!快速启动功能：2次

5、击键进入操作BrowserRun观察样品情况,调节色普图和峰高度orGoDoSomethingElse!DuoFLow软件系统ManualScreenDuoFLow软件系统Browser–EnterUserandMethodNameDuoFLow软件系统Setup–selecthardwareDuoFLow软件系统Protocol–entermethodDuoFLow软件系统PostRunOptions-ActivityDuoFLow软件系统PostRunOptions–PeakTaggingDuoFLow软件系统PostRunOpt

6、ions–TRACECOMPARE层析图比较单一柱子单一程序走不同样品单一样品和单一程序走不同柱子同一样品和柱子走不同程序DuoFLow软件系统DuoFLow软件系统DuoFLow软件系统纯化平台的硬件结构——层析介质与层析柱，原理与技术层析介质离子交换层析介质UnosphereQ，SMacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM亲和层析ProfinityIMAC金属螯合介质ProfinityEpoxide环氧亲和介质Affi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝

7、胶Affi-Prep多粘菌素介质Affi-Gel硼胶Affi-Gel配体固定化活化介质凝胶过滤层析介质Bio-GelP系列Bio-BeadsS-X介质羟基磷灰石介质（CHT）氟代羟基磷灰石介质（CFT）疏水层析介质Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附剂层析柱分析柱离子交换分析柱：UnoQ,SAminex分析柱——分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子羟基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I凝胶过滤分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHP

8、LC分析柱反相层析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各种层析介质的Cartridges——用于条件摸索MacroPrepCHTHICBio-ScaleMiniCartridgesUN