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《(医药卫生)层析分离纯化技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、层析分离纯化技术2001.11.28ShanghaiPudong1蛋白质纯化策略融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步亲和层析90-97%纯度更高纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化2简易纯化选择载体和标记纯化pGEX谷胱甘肽S-转移酶GSTMicroSpin™PurificationModule,GSTrap™,GlutathioneSepharose™FastFlowPQE 6x组氨酸HisMicroSpinPurificationModulepETHisTrap™,HiTrap™Chelating,
2、6x组氨酸ChelatingSepharoseFastFlowpEZZ18(非诱导性表达) 蛋白A的IgG结合区IgGSepharose6FastFlowpRIT2T(利用温度改变诱导)蛋白A的IgG结合区IgGSepharose6FastFlow3GST融合蛋白的纯化GST重组蛋白酶切位点FactorXa:Mr17-20000/28-30000Thrombin:Mr37000PreScission™Protease:Mr46000GlutathioneSepharose™Mr2600010C4任何规模纯化都比较简
3、单预装柱/填料一次可纯化GST注意 融合蛋白的量GSTMicroSpin™〈400µg立即可用,预装柱,PurificationModule缓冲液和试剂和MicroPlex™24Vacuum结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈48样品)GSTrap™1ml10-12mg立即可用,预装柱GSTrap5ml50-60mg立即可用,预装柱GlutathioneSepharose™4B8mg/ml可自行装柱GlutathioneSepharose410-12mg/ml可自行装柱，使用层析系统快速纯化，FastFlow适
4、合放大5GSTMicroSpin™PurificationModule立即可用,50预装柱含缓冲液和所需试剂可纯化每柱400µg,体积达400µl样品适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化6GSTrap™柱20分钟内每1ml柱12mg或每5ml柱60mg使用针筒，蠕动泵，或者ÄKTA™系统添加剂兼容适合快速和重复性高的要求7GSTrap™结合缓冲液平衡加样后用结合缓冲液冲洗废液收集用洗脱缓冲液洗脱收集组份3min5-15min2min8GSTrap™SDSPAGEanalysis020406080100%Elut
5、ionbuffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0mlminWashElutionbuffer2.7mgpureGSTfusionprotein5.010.015.020.0A280kD9414.420.1304367123柱:GSTrap1ml样品:8ml大肠杆菌表达含GST融合蛋白胞浆萃取液结合缓冲液:PBS,pH7.3洗脱缓冲液50mMTris™-HCl,pH8.0＋10mM还原谷胱甘肽流速:1ml/min层析 步骤:4CV结合缓冲液,8ml样品,10CV结合缓冲液,
6、 5CV洗脱缓冲液,5CV结合缓冲液(CV=柱体积)系统:ÄKTA™explorer101:低分子量标记(LMW)Calibrationkit,还原,AmershamPharmaciaBiotech2:胞浆萃取液,1g/10ml3:洗脱GST融合蛋白9GlutathioneSepharose™FastFlow适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，并用作放大每毫升填料可以纯化12mg融合蛋白装在XK空柱中和ÄKTA™平台纯化系统连接使用高流速兼容尿素，盐酸胍等10GST融合蛋白的检测检测方法注意GST96孔板EL
7、ISA检测试剂盒适合筛选表达系统和层析组份当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度时特别有用GST酶测定检测模组快速测定；适合筛选用途功能测定可以有效评估纯化出来的GST融合蛋白的活性，但可能需要自行设计和优化11GST融合蛋白的检测检测方法注意使用抗-GST抗体和高度特异,只检测GST融合蛋白ECL™检测系统的使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以免疫印迹法使背景大大减低，甚至去掉ECL检测系统提高免疫印迹的检测能力ECL提供大部分重组表达应用所需的灵敏度 需要更高灵敏度时使用ECLPlus.SDS-PAGE＋Cooma
8、ssie™提供分子量大小和%纯度讯息. 考马氏染色或银染可检测融合蛋白和污染物.12GST96-孔板ELISA检测试剂盒快速酶测定每块板可检测50样品适合筛选表达系统和层析组份13(His)6融合蛋白的纯化和检测重组蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+14任何规模纯化都比较简单预装柱/填料一次可纯化注意 融合蛋白的量
