限制性内切酶使用

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1、用UniversalBuffer和BasalBuffer进行限制酶活性表示TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液(UniversalBuffer)测定限制酶活性的体系(5种通用缓冲液中，用标注的)，以此时的活性值作为100%。并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。有()标记的是易受Star活性影响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用或标注的缓冲液。每种限制酶都有其自身的基本缓冲液(BasalBuffer)，其中AccⅢ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、C

2、fr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、PshBⅠ、SnaBⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11BⅠ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(BasalBuffer)。各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。限制酶在各种缓冲液中的相对活性 附带·活性测定用Buffer    推荐使用的Buffer *1+0.01%BSA→100%:AflII,Aor13HI,EcoO65I,FokI,Hin1I,MunI,Nco

3、I,PvuI,Sse8387I,XbaI *2+0.01%BSA+0.01%TritonX-100→100%:NotI按UniversalBuffer分类的限制酶  各UniversalBuffer的组成  ■使用注意事项10×Buffer都为10倍浓度的缓冲液。此外，10×T溶液中不含BSA，在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或TritonX-100，添附的溶液是10倍浓度(0.1%)的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。 

4、■保存-20℃ 反应停止液组份表(10×LoadingBuffer)1%        SDS60%        Glycerol0.05%        BromophenolBlue ■使用方法本公司的酶包装中全部附带有反应停止液。使用时请添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。-20℃保存时，会出现SDS沉淀，请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时，SDS有时也会出现沉淀，此时同样请于温水浴中将其溶解后使用。 ■保存开封后室温保存。DoubleDigestion(双酶切反应)时Universal

5、Buffer(通用缓冲液)的使用表■说明使用二种酶同时进行DNA切断反应(DoubleDigestion)时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。TaKaRa采用UniversalBuffer表示系统，并对每种酶表示了在各UniversalBuffer中的相对活性。尽管如此，在进行DoubleDigestion时，有时还会难以找到合适的UniversalBuffer。本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在DoubleDigestion可使用的最佳UniversalBuffer

6、条件。在本表中，各UniversalBuffer之前表示的[数字×]是指各UniversalBuffer的反应体系中的最终浓度。TaKaRa销售产品中添附的UniversalBuffer全为10倍浓度的缓冲液。终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。 ■注意◇1μgDNA中添加10U的限制酶，在50μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。◇根据DNA的种类，各DN

7、A的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生DoubleDigestion不能顺利进行的可能。pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶双酶切效果在基因工程实验中，经常要对DNA片段进行多种限制酶的酶切反应。但经过实验验证，对在DNA片段上相邻或相近的两个限制酶切位点进行双酶切反应时，往往达不到预期的效果。例如，对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的KpnI和SmaI进行双酶切时，酶切反应难以进行。而针对有些酶切位点进行双酶切时，酶切效果与酶切反应所用限制酶的顺序还有关系

8、。例如，要对SacI和KpnI这两个酶切位点进行双酶切时，如果先用SacI进行酶切，然后再用KpnI进行酶切，双酶切反应则无法进行。但是如果先用KpnI进行酶切，然后再用SacI进行酶切，双酶切反应则可以进行。造成这些结果的原因是因为进行限制酶的双酶切反应时，由于受到酶切位点周围碱基数量的影响，从而影响了酶切效果。本公司对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶进行双酶