限制性内切酶原理.ppt

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1、限制性核酸内切酶演讲者：王凯限制酶II型限制酶限制酶的定义1限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源

2、DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoRI和EcoRII，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）的HindII和HindIII。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。限制酶的发现命名EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号切割频率切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DN

3、A分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4。如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6bp，则其切割频率为(1/4)6=1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个bp，则其切割频率为（1/4）n。限制酶的种类2I型限制酶通常其切割位点与识别位点相距千个碱基,不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。II型限制酶所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。III型限制酶

4、切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。什么是回文序列？GAATTAAGCTTAATTCGAATATTCCTTATAAGII型限制酶ApaI识别序列：5'GGGCC^C3'BamHI识别序列：5'G^GATCC3'BglII识别序列：5'A^GATCT3'EcoRI识别序列：5'G^AATTC3'HindIII识别序列：5'A^AGCTT3'KpnI识别序列：5'GGTAC^C3'NcoI识别序列：5'C^CATGG3'NdeI识别序列：5'

5、CA^TATG3'NheI识别序列：5'G^CTAGC3'NotI识别序列：5'GC^GGCCGC3'SacI识别序列：5'GAGCT^C3'SalI识别序列：5'G^TCGAC3'SphI识别序列：5'GCATG^C3'XbaI识别序列：5'T^CTAGA3'XhoI识别序列：5'C^TCGAG3'II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。粘性末端和平末端5’NNNGTTAACNNN3‘3’NNNCAATTGNNN5‘5’NNNG

6、TTAACNNN3’3‘NNNCAATTGNNN5’5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘HaeⅠ的识别序列NotⅠ的识别序列5’粘性末端和3’粘性末端5’NNGCGGCCGCNN3‘3’NNCGCCGGCGNN5‘5’NNNGC-OHP-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-PHO-CGNNN5‘5’粘性末端3’粘性末端5’NNGGTACCNN3‘3’NNCCATGGNN5‘

7、5’NNGGTAC-OHP-CNN3‘3’NNC-PHO-CATGGNN5‘同尾酶切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡ同裂酶有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶

8、，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。例如：HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但XmaI的切点在C^CCGGG，形成带有CCGG的粘性末端；而SmaI的切点则在CCC^GGG，形成平末端。有些限制酶识别的序列不是回文序列。AccⅠ的识别切割位点分别是GTAGAC和GTCTACBbvCⅠ的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG特殊的II型限制酶GT↓ATCGACCATAGC↑TGCC↓TCAGCGGAGT