扩展青霉碱性脂肪酶基因的表达及分子突变

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1、福建师范大学硕士学位论文扩展青霉碱性脂肪酶基因的表达及分子突变姓名：袁彩申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：林琳2003.4.1扩碰青霉碱性黼舫酶基粥的表述及分子突变内容提要本文报道了扩艘静霉碱性脂肪酶(PEL)基因在也撕德毕券酵母中的表达及利朋蛋自袋。l：程改选PEL蒸因瓣骚究二￡僚。一、PEL基因在巴斯德毕赤酵母中的淡达，实现了扩展青霉碱憔脂肪酶基因巍毕赤酵母中的赢效表达。f袭选蟹自PEL-GS分泌至臻算基串，努予爨约28kD，鸟PEL夫枣稳谶，占分泌蛩角熬95％。翊不添加YNB、生物素及初贻pH7．0的培养熬，每24h添加1．5％甲醇诱导，进行重组酵母培养，培养7

2、2h发酵液酶活达260U／ml。j一一百“，二、PEL基舜熬定煮突变f定点突变获得突变蒸因PEL．P163A、PEL．D92L．井在毕赤酵母中表达。《突变体P163A袭达蛋白PEL．P163A．GS晟适反应温度为25℃，比PEL．GS降低了15"C；冈瓣对热敏感、对蛋自瓣不敏感。较甄激发(25℃)培粪瓣PEL,-GS、PEL-P163A-GS戆表达均肖促进作用，其对PEL-P163A寝达影响尤为髭著，GSopPIC3．5K-PEL25"C培养96h，上消酶活是28℃培养的2．3倍，25"C、初始pH7．35条件。F熔养72h，其酶活达270U／ml；GS-pPIC3。5K．PEL在檩网条

3、fFF培养96h，酶活选380U／ml。突变体D92L．袭这蛋鑫量大大下酶，28"(2；秘娥pH7。35条嘏二’F培养72h，主渣酶洼为20U／ml，仅为PEL-GS的7％。A——、》一一三、PEL基因的随机诱变翔弱错PCR火肠杆菌，获得与pPlC3．5K连接，转能平板筛蹦适于低温或对热稳定的煎组子，筛选获得一株最活殷鹿温度、热稳定性、发酵酶活均有提高的突交蒋PEL-ep5-GS，其簸活爰瘫温度为45"C，}￡舅生蘩菇窭5℃；40℃憝毽30rain残留活性为56％，大大高于野生型的6％；初始pH7．3528℃条件-卜培养72h，发酵上黼．gJ325U／ml。■—tf’一一关键词：护‘，幽

4、，茎垫．1鎏，低温酶p譬己o⋯一l扩艘青箨碱性日8舫酶耩溯舶袭i＆敷分≯突变AbstractPen耙itliumexpansranPF898is8mutantstrainobtainedbymanygenerationmutagenesistcanproduceanalkalinelipaseatahighlevel。ToresearchonthegeneandproteinstructureofthelipasefromPenicilliumexpansumPF898(designatedPEL)。improveitspropertyofcoId-activity．Wehavedone

5、theresearchasfollows=1．OverexpressionofPELgeneinPichiapastorisThealkalinelipasegeneofPenicilliumexpansum(PEL)WaScolonedintotheyeastintegrativeplasmidpPIC3。5K。whichWaSthentransformedintoHis4mutantyeastGSI15RecombinantPichiastrainswereobtained强minimaloliveoil-methanolplatesscreeningandconfirmedbyPC

6、R．TheexpressionproductsofPELgenewasanalysisbySDS—PAGEandoliveoilplate，andtheresultindicatedthatPELgeneWaSfunctionallyoverexpressedinPichiapastorisandup格鲐％ofthesecretedprotein．Recombinantlipasehad8molecularmassof28kD,showingarangesimilar协thatofPEkcouldhydrotyzeoliveoilandformedclearhalosintheolive

7、oilplates．Fourdifferentstrategies(differentmedia，pH，glycerolandmethanolconcentration)wereappliedtooptimizethecultivationconditions。TheactivityofIipasewasupto260u／mlafter72hundertheoptimalcultivationconditions．Itispoint