βcatenin在毛囊干细胞增殖与分化中作用的初步研究

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1、第三军医大学博士学位论文p—catenin在毛囊干细胞增殖与分化中作用的初步研究摘要毛囊是皮肤重要而复杂的附属结构，从内向外依次由毛干、内根鞘和外根鞘组成。隆突区是毛囊上段外根鞘向外隆起的部分，位于皮脂腺导管开口的下方，是立毛肌的附着处。在体实验显示隆突区细胞具有多向迁移能力，不仅能向下端毛球部迁移参与毛囊形成，而且能向上迁移参与表皮更新和皮脂腺维持。目前普遍认为毛囊上段隆突区存在原始干细胞群，称为毛囊干细胞(hairfolliclestemcells，HFsCs)，毛囊隆突区干细胞在毛囊周期的维持以及组织的形成中发挥重要作用。尽管静息状态的毛囊干细胞呈慢周期性，但在外来信号刺激下，则表现出

2、很强的增殖潜能力和克隆形成能力，是上皮各类干细胞中最具增殖潜力的干细胞库，并被认为是皮肤中表皮、毛囊和皮脂腺重要的细胞来源。但是直到现在对毛囊隆突区干细胞体外培养及其生物学性质仍了解甚少。本实验中采用改良消化法得到完整的毛囊，并根据隆突区形态特征，在体外显微切割分离毛囊隆突区，成功地进行细胞原代和传代培养，为深入研究毛囊干细胞生理功能及调节机制奠定了基础。B一连环蛋白(B—catenin)是一种胞内糖蛋白，具有双重功能。一是作为附着连接的组成部分，与钙粘蛋白结合形成复合体参与细胞间连接；二是作为信号分子，是Wnt信号途径的重要环节，在胚胎发育和肿瘤发生中起重要作用。Wnt蛋白与相应受体结合将

3、启动该信号途径，引起D—catenin在细胞内的堆积，p—catenin随之转入到细胞核中，通过与Lefl结合激活下游靶基因。最近研究发现p—catenin对于毛囊的发生发育是不可缺少的因素。在胚胎期，毛囊发育过程中如果D—catenin基因发生突变，毛囊的正常形成途径受阻；同时毛乳头可以促进毛囊干细胞定向分化，B—catenin作为重要调节因子参与毛囊干细胞分化途径的选择。为了更加清楚地了解D—catenin在毛囊干细胞增殖分化中的作用，本实验从以下几个方面开展研究：p—catenin及其相关粘附分子、信号分子在毛囊周期中的表达；毛囊干细胞体外分离培养及生物学性状观察；D—catenin在

4、体外培养毛囊干细胞中的表达变化，其入核机制与Lefl的关系；B—catenin对毛囊干细胞增殖的影响以及cyclinDl、C0x2的表达意义；p—catenin在毛乳头细胞定向诱导毛囊干细胞分化中的作用；最后将毛囊干细胞与毛乳头细胞混合移植到裸鼠皮内，观察毛囊再生情况及相关因子的表达。主要结果如下：第二军医大学博士学位论文1．在测定毛囊周期的基础上，采用免疫组化技术检测D—catenin及其相关粘附分子和信号分子在毛囊发育及正常周期中的表达，结果显示：(1)确定大鼠毛囊周期约为28d，其中1—18d为生长期，19—22d为退化期，23—28d为静止期。B—catenin在生长期毛囊中呈强表达

5、，而在退化期和静止期表达微弱，提示B—catenin参与毛囊周期维持并发挥作用。(2)B—catenin的表达与毛囊发育的不同阶段具有相关性，主要出现在发育早期和成熟的毛囊中，提示B—catenin可能在启动毛囊发育中发挥作用；而DKK4阴性表达则反映此过程涉及到wnt信号的激活。(3)细胞粘附分子E—cadherin和a—catenin同样在毛囊周期中呈周期性表达，与D—catenin表达相类似，说明E—cadherin和u—catenin参与毛囊周期维持，并可能通过D—catenin发挥作用。(4)Lefl促进生长期毛囊细胞的生长，作为B—catenin核内转录因子调节毛囊正常周期。2．

6、完善了毛囊隆突区干细胞体外分离、培养的方法，观察毛囊干细胞的形态特征和生长状况，以及p—catenin在毛囊干细胞中的转位表达，并探讨了Lefl对p—catenin入核作用的调节机制，主要结果和结论如下：(1)用采用显微分离和酶消化两步法培养可得到活性较好的毛囊干细胞。(2)B—catenin在细胞内的表达随培养时间延长出现转位现象，同时细胞粘附分子E—cadherin的表达部位也发生改变，而程一catenin变化不明显。(3)扩增NL—Lefl和NS—Lefl质粒，转染后可见NL—Lefl促进细胞中D—catenin向核内转移，而NS—Lefl作用不明显，因此Lefl可能是p—cateni

7、n入核重要的调节因子。(4)结合细胞生长曲线和p—catenin转位表达，提示p—catenin入核可能与细胞增殖有关。3．采用转染、MTT、RT-PCR和westemblot等技术研究了B—catenin在毛囊干细胞增殖中的作用，并初步探讨其相关的信号机制，主要结果和结论如下：(1)“cl提高细胞中内源性B—catenin表达水平，并表现出时间和剂量依赖性。(2)LiCl通过增强细胞内p—catenin表达