泡桐生活胚囊的分离及细胞学观察

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1、第24卷第3期南京林业大学学报Vol.24No.32000年5月JournalofNanjingForestryUniversityMay.2000泡桐生活胚囊的分离及细胞学观察李湘阳周竖(南京林业大学森林资源与环境学院南京210037)摘要采用酶解结合机械震荡法分离出泡桐(Pαulo川úafortunei)的生活胚囊。选择新鲜泡桐的胚珠，用果胶酶、纤维素酶、离析酶等混和酶液在28-30oc下处理2.5-3h，并结合机械震荡分离胚囊。经醋酸洋红染色，于OlympusAHB-2型显微镜下观察，用荧光染料DAPI染色观察生活胚囊内部组成。看到了完整的泡桐生活

2、胚囊的形态。从形态结构上看，胚囊内部各成分没有因酶解发生很大的变化。关键词泡桐;胚囊分离;酶解机械震荡法;生活胚囊中图分类号S718文献标识码A文章编号1000-2006(2000)03-0037-04IsolationandMorphologicalObservationofViableEmbrvoSacinPaulowniafortuneiLiXiangyangZhouJian(CollegeofForestR臼ourc臼andEnvironmentNanjingForestryUniversityNanjing210037)AbstractThee

3、nzyme-shakingtechniquewasusedtoisolatetheviableembryosacofPαulowniafortunei.Freshovuleswereenzymaticallymaceratedinmixturesolutionincludingdifferentcontentofpictinase(Y-23),cellulase(R-lO)andmacrozyme(R-lO)etc.for2.5-3h,at28-30oC,undertheshakingcondition,toisolatetheembryosac.Cyt

4、ologicalstructureofthewholeviablesacwasobservedunderOlympusAHB-2microscopeafteracetσcarminestainingorDAPIstaining.KeywordsPαulowniafortunei;Isolationofembryosac;Enzyme-shaketechnique;Viableembryosac分离植物生活卵细胞是进行植物生殖细胞工程研究的基础之一，但卵细胞位于胚囊之中，因此分离生活胚囊是分离生活卵细胞的第一步。前苏联学者最早采用酶解法酶离胚珠得到生活胚囊

5、。我国学者在金鱼草和烟草中进行了分离生活胚囊的研究工作[1-3]。目前己从多种植物中分离出生活胚囊及其组分。j包桐是我国常用的速生型造林树种，在我国有很大的栽培面积。从泡桐的生物学特点上看，泡桐的胚珠小，薄珠心，易于酶解;同时，在一个子房内有很多的胚珠，取材十分容易，所以是较为理想的木本植物研究材料。对于经固定处理的胚珠，杨弘远等用酶解技术酶离出泡桐胚囊，观察了大于包子发生和雌配子体的发育过程[4]。笔者用酶解法直接分离新鲜胚珠获得了分离的生活胚囊。1材料和方法1.1采集胚珠实验材料是采自南京林业大学校园内的泡桐(PαI山wniafortune.)，该树

6、每年都正常开花结实。5*收稿日期1999一11-24基金项目·江苏省自然科学基金项目(No.BK97148)第一作者简介:李湘阳(1970-)，女，湖南宁远人，南京林业大学森林资源与环境学院硕士生。-37一南京林业大学学报第24卷第3期月初，采集开花1周左右的花朵;在实验室，剔除花托和花瓣，剥离出子房;去掉子房壁，从子房内取出用于分离生活胚囊的新鲜胚珠。1.2酶解胚珠及观察方法胚珠的酶解参照一般的林木体细胞原生质体分离和酶解泡桐固定胚珠的方法。根据新鲜材料的特点并依据泡桐生活胚囊的特点以及不同酶的特性，组合设计了6种混合酶解液，以寻找较好的并适宜泡桐生活

7、胚囊的酶解液(表1)。为维持渗透压的平衡，在各混合酶液中加入0.65mol/L的甘露醇。配置好的酶液在冰箱中静置一夜后，取土清液使用。进行酶解处理时，应尽量避免对泡桐胚珠的伤表1酶配方表害。用解剖针将新鲜的胚珠从子房中取出立即放T'able1Enzymeconstitution入10mL的玻璃试管中。加入3mL左右的混合酶自己方%酶种类23456酶。每种混合酶解液置于一个玻璃试管中，共6个纤维素酶R-lO1.001.501.001.501.50试管。用于充分摇匀使胚珠完全浸没在酶液中。纤维素酶RS0.500.500.500.50再将这6个玻璃试管用支架固

8、定好，放在震荡器上离析酶R-101.001.001.001.00果胶酶Y-23O