莴苣和美丽异木棉的胚囊细胞分离

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1、厦门大学硕士学位论文莴苣和美丽异木棉的胚囊细胞分离姓名：陈琳申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：田惠桥201106摘要被子植物具有独特的双受精现象，姊妹精细胞中的一个与卵细胞结合发育成胚，另一个与中央细胞结合发育成胚乳。受精过程中，精细胞通过花粉萌发的花粉管进入胚囊，继而完成双受精。整个受精过程都是在由体细胞组织形成的花柱、子房和胚珠内完成。因而对于研究受精机理问题形成了障碍。将高等植物的精、卵细胞和其他胚囊细胞分离出来，在体外诱导精、卵融合及对人工合子和其他胚囊细胞的培养再生植株将可克服

2、体细胞组织的障碍，从而进行细胞和分子水平的研究，达到揭示被子植物受精机理的目的。在本实验中，我们选取了莴苣和美丽异木棉两种不同的植物作为研究材料，分别成功分离得到了一定数量的具有生活力的卵细胞、助细胞、中央细胞等胚囊细胞，以及合子、二胞原胚、四胞原胚等早期原胚细胞，为开展研究这两种植物的受精机理扫清了主要障碍。1．莴苣胚囊细胞及早期原胚的分离：莴苣为一室子房，具有一个倒生胚珠，其胚囊成熟时只剩下4个胚囊细胞，包括一个卵细胞、两个助细胞和一个中央细胞，反足细胞已完全退化。两个助细胞极性相同，有时还能

3、观察到丝状器结构，而中央细胞体积最大，因而很容易辨别出各个胚囊细胞的身份。根据莴苣的开花规律，选取了开花前一天，开花当天及开花第二天的花，采用酶解一一解剖的方法进行分离。从开花前一天至开花第二天的花中均能分离出一定数目的卵细胞，但是卵细胞状态表现出差异：随着时间的向后延长，卵细胞液泡化程度增加，极性愈强。开花第二天的花中已很少能分离出助细胞，推测已退化。而中央细胞在开花后6h的花中也很难分离出，可能已经发生受精。从开花后6h的花中分离得到合子，其体积与卵细胞相比明显缩小，而且活性荧光分布均匀。在此

4、基础上，我们还进一步分离出莴苣早期原胚细胞，包括二胞原胚，四胞原胚，五胞原胚及多细胞原胚。四胞原胚和五胞原胚的形成说明莴苣原胚阶段细胞分裂方式的多样性。莴苣卵细胞、助细胞、中央细胞、合子、二胞原胚、四胞原胚、五胞原胚和多细胞原胚的分离，为体外研究卵细胞至多细胞原胚的发育提供了很好的实验基础。分离得到的大量生活卵细胞还可为构建莴苣卵细胞cDNA文库、研究卵细胞发育的分子生物学特性提供基本材料。2．美丽异木棉卵细胞和助细胞的分离：美丽异木棉为木本植物，花单生。实摘要验中，我们采用酶解一一解剖的方法成功

5、分离得到大量的卵细胞和助细胞。美丽异木棉的卵细胞呈空泡状，从胚囊释放出来后极易飘至液面，而对其进行FDA活性染色可以清楚地观察到位于细胞周边的细胞核，可能是受到大液泡的挤压所致。对开花第一天至第四天花中分离的卵细胞体积进行测量，没有发现显著差异。将分离的卵细胞收集，进行细胞和分子生物学方面的研究，为研究木本植物提供了一个新的途径，同时也为在木本植物中进行离体受精和育种奠定了基础。助细胞的细胞质致密，液泡体积小。按照我们的实验操作，可以分离得到一定数目的的助细胞，为研究助细胞间的发育和功能打下了很好

6、基础。关键词：莴苣；美丽异木棉；卵细胞；助细胞；中央细胞；原胚细胞；分离IIAbstractDoublefertilizationinhigherangiospermisauniquephenomenon，oneofthetwospermcellsfusing谢tlleggtoformembryo．andtheother晰tllthecentralcelltoformendosperm．SpermcellsentertheembryosaCthroughthepollentube，andthenc

7、ompletethedoublefertilization，whichisdoneinvivosurroundedbytissuecells．Therefore，itisdifficulttostudytherecognitionofspermandegg，zygoteactivation，thestartofearlyembryodevelopmentandSOon．FollowingtheSUCCESSisolationofsperm，eggcellsandotherembryosac，the

8、fusionofbothgametesinvitroCanbeconductedandstudyingoftheembryosaccellsandzygotecallbecarriedwithmodemcytologicalandmolecularmethods，whichmakesitpossibletostudythefertilizationmechanismwithouttheinfluencesofsomaticovaryanovuletissue．Inthisexper