金黄色葡萄球菌TRAP蛋白及VraX蛋白的生物学功能研究

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1、中图分类号QZ!UDC570硕士学位论文学校代码!Q墨墨墨密级公开金黄色葡萄球菌TRAP蛋白及VraX蛋白的生物学功能研究ThestudyonthefunctionofTRAPandVraXinStaphylococcusaureus作者姓名：谭小蓉学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学学院(系、所)：生物科学与技术学院指导教师：杨光研究员论文答辩日期塑!查：墨：17答辩委员会主席塑l中南大学二O一三年五月原刨性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽

2、我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：驷!篮一日期：望垒—年互月卫日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权

3、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：塑阻导师签名乏(蝗日期：三咀卜年上月卫日金黄色葡萄球菌TRAP蛋白及VrⅨ蛋白的生物学功能研究1．TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金黄色葡萄球菌的机制研究；2．假定蛋白VraX参与金黄色葡萄球菌天然耐药的机制研究摘要：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，金葡菌)是一种常见的革兰氏阳性致病菌，广泛分布于自然界中，通过飞沫、接触等途径传播并引起多种疾病。当金葡菌侵入机体

4、时，机体会通过补体系统、吞噬细胞、不饱和脂肪酸等多种防御系统清除入侵细菌。同时金葡菌自身在感染机体的过程中，也会表达多种分子对抗机体的清除作用。近年来由于抗生素滥用，导致了多种耐药性金葡菌的出现，耐药金葡菌引发的感染是临床面临的棘手难题。本论文主要针对以下两个内容展开了相关的研究，具体如下：①TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金葡菌的机制研究；②假定蛋白VraX参与金葡菌天然耐药的机制研究。本研究的第—部分为TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金黄色葡萄球菌的机制研究。长链不饱和脂肪酸一般指_>C1

5、6，含有一个以上双键的脂肪酸。相关研究表明，该类脂肪酸是天然免疫系统中重要的组成成分，具有抗金葡菌感染的能力。TRAP是金葡菌致病性相关的蛋白分子，目前关于它的生物学功能存在争议，其确切功能尚不清楚。该部分内容具体如下：1．Atrap对亚油酸的敏感性检测：我们实验室前期通过基因同源重组的方法获得了traP基因的缺失突变株(AtraP)，当其与亚油酸进行共孵育培养时，与野生型菌株相比，其存活率明显降低。通过基因芯片对比分析我们发现在△砒沪中与脂代谢相关联的基因fadD的mRNA水平明显降低。2．Afad

6、D对亚油酸的敏感性检测：我们通过基因同源重组的方法获得了fadD基因缺失突变株(AfadD)。进一步的实验结果发现，AfadD对亚油酸敏感性也明显增强。我们在么traP中回复fadD的水平，但其对亚油酸的敏感性未得到回复。3．TRAP蛋白通过与FadD蛋白相互作用参与亚油酸杀伤金葡菌的过程：通过免疫共沉淀实验及质谱鉴定的方法，我们发现FadB和FadD可能是TRAP的结合蛋白。进～步的ELISA实验结果表明只有FadD蛋白能够特异与TRAP蛋白结合。这表明TRAP蛋白通过与FadD蛋白相互作是其影响亚

7、油酸对金葡菌杀伤的主要机制。本论文的第二部分为假定蛋白vrax参与金黄色葡萄球菌天然耐药的机制研究。天然耐药是指在抗生素作用下，抗生素敏感细菌中的一部分可以存活和繁殖，成为接收外来耐药基因的载体。研究表明抗生素作用下，金葡菌中的多种分子异常表达对抗药物的杀伤作用。通过文献调研发现，多种抗生素处理后金葡菌假定蛋白VraX的水平明显升高(>20倍)。本部分研究中，我们主要探索VraX参与金葡菌天然耐药的机制研究，具体内容如下：1．VraX蛋白与金葡茵的天然耐药明显相关：我们通过基因同源重组的方法获得了vr

8、oK基因的缺失突变株(zxvraX)。药物敏感性检测实验结果表明zxvraX对多种抗生素敏感。2．RNaseⅢ调控金’黼中vraX的水平：我们通过RNA-pulldown实验中证实RNaselII能够结合vraX，基因芯片对比分析发现ARNase]]_I中vraX的水平明显升高，我们利用RT-PCR及qRT-PCR验证这一结果。进一步的凝胶阻滞实验证实RNaselll可以特异的结合vraXo同时降解实验表明，在M92+存在的条件下vraX可以被RNase