羊水栓塞的法医学研究

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1、中山大学博士学位论文羊水栓塞的法医学研究姓名：安峰申请学位级别：博士专业：法医学指导教师：陈玉川2003.5.20!坐查堂竖主兰垡垒塞窒堕!塑!堡鲨堕兰主兰兰—————————!苎!!垩一羊水栓塞的法医学研究专业：法医学博士生：安峰指导老师：陈玉川教授摘要／／羊水栓塞(amnioticfluidembolism，AFE)是羊水进入母体血液循环后引起的一系列严重症状的综合症“’21，它是一种少见而严重的产科并发症，由于起病急骤、病情凶险、无先兆症状，因而死亡率高，常常引起医疗纠纷。羊水栓塞的发病机制目前还存在争议，有学者认为主要是机械性栓

2、塞和凝血功能障碍。’“，也有学者认为主要是羊水导致的过敏反应”’“。由于发病机制的不确定，羊水栓塞的诊断标准也尚未统一，各家的报道不尽相同1“!o。，除了主要依靠l临床表现外，在客观辅助检查指标的选择上还不一致。尤其是，对于死后羊水栓塞的诊断迫切需要解决的问题是规范化。羊水栓塞的病理学和法医学诊断，向来主要是建立在羊水成份的观察上，认为在母体血液循环中查到胎儿的组织成份(毳毛、胎粪、上皮细胞等)是诊断的关键，后来在正常分娩的母体微循环内也发现了羊水的有形成分，说明这个指标并非十分特异⋯’”。。自从羊水栓塞的过敏假说被提出之后，人们一直在

3、努力寻找这一理论的客观依据，在临床工作和实验研究中获得了大量有价值的资料，目前这一理论正在被越来越多的学者证明和接受，一些新的诊断方法从免疫学的角度来诊断羊水栓塞，获得了良好的效果““。1“1。但是，直接筛选出导致羊水栓塞的过敏原存在一定困难，关于羊水栓塞过敏理论的证明以及羊水栓塞的诊断，还要进一步探索。i—产—～／本研究旨在：①选择粘膜型肥大细胞系RBL．2H3为研究对象，观察在羊水抗原的刺激下细胞的组胺释放，以及相关的形态学改变，试图在细胞水平证明羊水可以直接导致肥大细胞发生脱颗粒反应，为羊水栓塞的过敏机制提供一定的实验依据。②寻找

4、一种特异、灵敏、实用的羊水栓塞的诊断方法。发献报道“’’”：定量检测血清和脏器微血管中MUC2，MUC3粘蛋白的特征性寡糖抗原乙酰神经氨酸乙酰半乳糖胺(SialylTn，NeuAcu2-6GalNAcctl一O-Ser／Thr)后发现，SialylTn抗原的检出量和羊水栓塞的发生密切相关，羊水中的MUC粘蛋白是诊断羊水栓塞的特异而敏感的指标。因此，厂本研究通过克隆、表达和纯化人MUC2，MUC3主坐查兰堕圭堂垡堡塞窒些!!!!丝鲨堕堂主些一．—————!竺：!!窭-粘蛋白寡糖链结合区(PTS功能区)蛋白，用于筛选抗人MUC2，MUC3粘

5、蛋白的抗体以检测脏器微血管中的MUC粘蛋白诊断羊水栓塞。③针对筛选出的基因工程抗椿需要进行产生方式的转换而大量表达的问题，本实验对基因工程抗体Fab片段的原核表达方法进行了研究，为今后表达抗人MUC2，MUC3的基因工程抗体，进而建立诊断羊水栓塞的免疫学方法奠定基础。f材料和方法1．大鼠羊水致RBL．2H3肥大细胞脱颗粒的检测1．1实验分组SD怀孕大鼠6只，无菌条件下取大鼠羊水，用所得羊水和肥大细胞共培养，共培养按羊水浓度和作用时间双因素进行分组，羊水浓度有全羊水、二倍稀释和四倍稀释三种情况，作用时间分为5min、30min、60min

6、三个阶段，所分得的实验组共9组，各组样本例数都为6例，另取不加入羊水的细胞为组胺自发释放组。1．2主要试剂和仪器设备RBL．2H3细胞，EMEM培养基，组胺测定试剂盒，AnnexinV-Fluosstainingkit，小牛血清，流式细胞仪。1．3细胞脱颗粒的检测测定实验组培养上清的组胺以及总组胺和自发释放组上清的组胺，用公式【(实验组上清组胺一自发释放组胺)／(总组胺一自发释放组胺)】×100％计算组胺释放率。将细胞用阿利新蓝染色，根据阳性细胞数计算脱颗粒指数。用流式细胞仪检测细胞AnnexinV-FITC阳性的细胞数，计算阳性细胞率

7、。2．人MUC2，MUC3粘蛋白PTS重复区的克隆、表达和纯化2．1质粒，菌株，主要试剂和主要仪器表达载体pQE一30，大肠杆菌M15，大肠杆菌XLI．blue。DNA抽提试剂盒，PCR试剂盒，抗人MUC2，MUC3杂交瘤单克隆抗体，异丙基硫代一13．D半乳糖苷，DU一6400型核酸蛋白自动分析仪。2．2人MUC2，MUC3蛋白的克隆表达纯化和鉴定采取人外周血，离心分离淋巴细胞。抽取细胞总DNA，以抽取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，用T4连接酶连接质粒DNA和目的基因MUC2、主坐查兰竖主堂焦堕苎室竺!竺!堡鲨堕兰主些一——

8、————!苎i!垩__MUC3，将阳性质粒转化大肠杆菌，培养表达后，用Ni-NTA-Agarose柱进行亲和层析，纯化目的蛋白，对所获蛋白进行SDS．PAGE分析，观察蛋白纯度。作WESTERN—BLOT，