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时间:2019-05-09
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1、第四次试验ELISA法血清抗体检测免疫胶体金法检测早早孕免疫学教研室※重点实验※(写实验报告)&血清抗体的检测:第一周:免疫小鼠(腹腔注射5%绵羊红细胞SRBC)、EILISA板抗原包被以及封闭第二周:小鼠眼球取血分离血清(96h后已经产生特异性抗体,存在血清中)第四周:ELISA实验检测血清中抗体水平(ELISA后续步骤)成绩课堂表现及出勤情况,占5分实验报告,占10分期末考试,占10分复习第一次课操作SRBC冻融稀释(得到比例适当的抗原,非完整的红细胞)↓每孔加包被液(碳酸盐缓冲液,含抗原)100μl,37℃1h(包被)↓弃去孔中液
2、体,用PBS洗板3次,每次均拍板↓加封闭液,每孔200μl,37℃,30min(封闭)↓弃去孔中液体,用PBS洗板3次,排干后4度保存包被和封闭ELISA板(复习)包被和封闭是ELISA前两个步骤,第一次课已经完成。包被就是将已知抗原或抗体非特异性,物理性吸附于固相载体表面并保持其免疫学活性。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。洗涤:不论是包被还是封闭后,我们都用PBST洗液洗涤三次,目的是去除游离的未结合的物质,从而保证试验结果的特异性及稳定性。阳性阳性阴性待测一阴性待测一待测二待
3、测二1待测一本组待测血清样本1:20稀释,待测二邻组待测血清样本1:20稀释。21:20稀释50μl待测血清+950μlPBS3每孔加对应液体(注意混匀)100μl,阳性孔和阴性孔分别加入100μl的阳性、阴性对照液。加不同液体注意更换枪头,不要串孔。并做好标记5统一放入37度孵箱1h(大于1h)ELISA步骤包被↓封闭↓加入待测样本↓加入酶标二抗↓加入底物↓加入终止液,终止反应加入酶(HRP)标记二抗1弃液2用PBS洗板3次,200μl/每孔,每次一分钟以上,水平轻微晃动,切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板,拍干。3于8个ELISA孔中
4、加入酶(HRP)标记二抗,100μl/每孔。4加完后统一放入37度温箱1h(大于1h)。加入底物-酶促反应-反应终止1弃液2用PBS洗板7次,200μl/每孔,每次一分钟以上,水平轻微晃动,切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板,拍干。3于8个ELISA孔中分别加入底物100μl/每孔。4加完后,室温避光反应10min。5反应10min后,于8个ELISA孔中分别加入终止液,50μl/每孔。标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上,连接某一个特定的、容易检测的分子或原子(标记物),利用标记抗体能与相应抗原结合的特性,通过标记物的检测,从而确定抗原的存
5、在部位。标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体、酶标记抗体和同位素标记抗体等。此外尚有铁蛋白标记抗体,主要用于免疫电镜的技术,在亚细胞水平上进行抗原定位。基本类型放射性核素标记技术免疫荧光技术免疫酶技术1.免疫荧光技术即免疫荧光细胞组织化学技术,是根据抗原抗体反应的原理,采用荧光素标记的已知抗体作为探针,检测待测组织、细胞标本中的靶抗原,形成的抗原-抗体复合物上带有荧光素,在荧光显微镜下,发出明亮的荧光,这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算抗原的含量,以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。分为
6、直接法、间接法、补体法、双重免疫荧光染色。方法1、直接法:这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体,染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育,使之直接与载玻片上的抗原结合,在荧光显微镜下直接观察,作出判断。该方法评价:简单易行、特异性高、快速方便,常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质,敏感性较差,效果有时不理想,目前较少作为更多方面的检测。2、间接法:该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后,继用间接荧光抗体,与前面的抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧
7、光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价:由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。目前本法应用较广泛,只需制备一种种属荧光抗体,即可适用于多种第一抗体的标记显示。方法3补体法:是间接法的改良。它是采用特异性抗体同新鲜补体混合后再与切片上的抗原反应,补体就结合在抗原-抗体复合物上,再用抗补体的荧光抗体与补体结合,形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物。这种方法不仅具有间接法的敏感性,而且荧光抗体不受免疫血清的动物种属限制,一种荧光抗体就能检测所有的抗原抗体系统;缺
8、点是较间接法更容易出现非特异性染色,且补体不稳定,每次均要采取新鲜血清,操作上比较麻烦。4双重免疫荧光染色:即可在同一标本上定位定性检测两种抗原。如A抗原的抗体用荧光素罗丹明标记,呈橘红色,而
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