（精）生物物理化学实验报告——itc

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1、结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCaliTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG=RTlnKD和Δ

2、G=ΔH-TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。MicroCaliTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。1通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。决定曲线形状的主要参数是C值：C=滴定池中的蛋白浓度/KD=[M]tot/KD×NC值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。一般C值在10-100之间实验效果最好。2实验材料：蛋白

3、质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。②注射器移到“RestPosition”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。③在“Instrumen

4、tControl”界面中点击“SyringeFill”，检查连接是否正常，点击OK；④将注射器移到“LoadingPosition”，针头插入到试管中，点击OK；⑤仪器开始自动吸取样品，检查是否加满。将白色细管轻轻旋下，放回原位。3⑥如果样品池已经加入样品，将注射器完全置入样品池中，便可开始滴定。⑵样品池加样①确认样品池、玻璃注射器均已清洗；②用玻璃注射器吸取300μl样品，轻弹注射器壁赶出气泡；③将注射器对准样品池孔（中间孔）慢慢插入，轻轻碰触底部后抬起约1mm；④用手稳住针筒，缓慢推入样品直至溢出样品池孔，其间不能抬升针筒；⑤慢慢吸

5、取少量样品并快速推出，重复几次赶出样品池内的气泡；⑥如果有多余的液体，用针筒吸掉；⑦以同样方法在参照池内加入水或者Buffer。3.在仪器软件上设置总注射次数、样品池温度、参照功率、注射器和样品池的样品浓度、搅拌器转速、单次滴定体积、样品单次注射时间、两次滴定的间隔时间和数据输出频率等参数，待图像基线跑平后开始滴定。4.按照软件提示清洗样品池和注射器。5.分析所得的滴定曲线和曲线参数，如有必要可多次实验，直到得到满意的曲线。4实验结果：第一次滴定（图B）时，蛋白质浓度相对过高，蛋白质结合太强，使得滴定反应进行过快，所以没有得到好的滴定曲

6、线；第二次滴定（图C）时，蛋白质浓度稍作调整，曲线C值变小，可用性更强。第三次滴定时（图A），蛋白质浓度比为1:5（样品池：注射器），蛋白质浓度8-1进一步降低，此时滴定曲线较好，可得两蛋白质亲和常数KD约为1.57（+-1.01）×10·M，反应焓变ΔH约为-12640（+-130.2）cal/mol=-52921.2（+-545.1）J/mol，反应熵变ΔS为-4.90cal/mol/K=-20.5J/mol/K，N为0.459即结合比约为1：2，反应自由能变化为ΔG=-RTlnKD8=-8.314×298×ln1.57×10≈-4

7、6.76KJ/mol，或ΔG=ΔH–TΔS=-52921.2+298×20.5≈-46.8KJ/mol。5图A图B6图C7