hnrf1tcf11对肝细胞癌生物学行为的影响及其相关机制研究

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1、hNrf1/TCF11对肝细胞癌生物学行为的影响及其相关机制研究重庆大学博士学位论文博士生：陈佳瑜指导教师：吕凤林教授副导师：张义国教授专业：生物医学工程学科门类：工学重庆大学生物工程学院二O一五年十月MechanismsbywhichhNrf1/TCF11ControlstheBiologicalBehaviorsofHumanHepatocellularCarcinomaAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDoctor’sDegreeof

2、EngineeringByJiayuChenSupervisedbyProf.FenglinLvAssistantSupervisedbyProf.YiguoZhangSpecialty:BiomedicalEngineeringBioengineeringCollegeofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaOctober,2015中文摘要摘要肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球范围内癌症相关死亡的常见原因。跨核膜抗氧化转录因子Nrf1(nuclearfactor-erythroid2p45

3、submit-relatedfactor1)是Cnc-bZIP(cap‘n’collarbasic-regionleucinezipper)即Cnc碱性亮氨酸拉链亚家族成员之一，通过调控下游抗氧化酶、解毒酶、26s蛋白酶体亚基基因的转录，保护细胞和组织免受氧化应激的影响，引发细胞进行适应性变化以维持[1,2]机体内平衡。研究证实在成年小鼠肝脏特异敲除Nrf1会诱发肝细胞癌。O连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）单糖修饰是细胞为满足不同生物学功能需要，进行的快速、可逆、动态的蛋白质翻译后修饰，由体内的唯

4、一的O-GlcNAc糖基转移酶（O-GlcNAcTransferase,OGT）催化进行。O-GlcNAc修饰的异常与肿瘤发生、迁移和侵袭过程密切相关，在肝[3]细胞癌形成和发展中起着重要作用。近期液相色谱-光谱法检测提示，OGT可以与Nrf1蛋白相互作用，因此，探讨糖蛋白Nrf1和O-GlcNAc修饰的关系，以及O-GlcNAc修饰对Nrf1生物学功能及Nrf1在肝细胞癌发生发展中作用的影响，将为Nrf1缺失诱发HCC发病机理、临床病理联系及预后判断提供新的思路。研究方法与结果：①敲减hNrf1/TCF11对人肝癌细胞生物学行为的影响我们首先用WesternB

5、lot检测hNrf1/TCF11在人正常肝细胞HL-7702及不同肝癌细胞系中的表达，发现hNrf1/TCF11在人正常肝细胞HL-7702中高表达，而在不同肝癌细胞系中hNrf1/TCF11的表达较低。接下来构建hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒载体，筛选出沉默hNrf1/TCF11最有效的shRNA靶序列为：ACAACCTGAGGAATACCTT。利用构建好的hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒载体及NegativecontrolshRNA空载质粒病毒载体转染人肝癌细胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L，建立稳定敲减hNrf1/TCF11

6、细胞系，分别命名为shNrf1实验组和shNC阴性对照组。MTT、细胞克隆形成实验观测细胞增殖情况，结果均显示在HepG2细胞中敲减hNrf1可促进细胞增殖，而在另外两株肝癌细胞shNrf1-MHCC97H、shNrf1-MHCC97L与对照株shNC间无明显差异。流式细胞技术测定各组细胞的细胞周期及凋亡，结果提示，实验组（shNrf1）细胞出现了G2/M期停滞，而仅在HepG2细胞敲减hNrf1后细胞早期凋亡率明显增加（p<0.05），而在其他两株肝癌细胞中未见明显变化。最后我们用细胞划痕体外迁移实验及Transwell侵袭实验观察细胞运动能力，I重庆大学博士

7、学位论文结果显示在HepG2、MHCC97H、MHCC97L中敲减hNrf1(shNrf1-)后迁移及侵袭能力均较对照组(shNC-)明显增强（p<0.05）。②敲减hNrf1/TCF11对肝癌细胞迁移、侵袭影响的机制研究用Real-timePCR检测shNrf1-HepG2中与肿瘤转移相关基因的表达，发现MMP-2、MMP-9表达显著升高，CDH1表达显著下调（p<0.05）。WesternBlot检测各株shNrf1实验组和shNC阴性对照组细胞E-cadherin、Vimentin及MMP-9的表达量，结果再次证实敲减hNrf1/TCF11使肝癌细胞发生了

8、上皮间质转化（EMT）。