ago1影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究

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1、学校代码：10246学号：09211210024硕士学位论文AG01影响肝细胞转移复发的机制及其预后价值的研究院系：中山医院专业：外科学姓名：周嘉敏指导教师：王鲁教授兀成曰期：2012年4月1复旦大学硕士学位论文论文题目AG01影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究ThestudyofAG01effectingonmetastasisandrecurrenceanditsprognosticvalueinhepatocellularcarcinoma院系：中山医院专业：外科学姓名：周嘉敏指导教师：王鲁教授

2、导师组成员：赵一鸣博士朱小东博士目录中文摘要1英文摘要3正文弓6第一部分：AG01在肝癌细胞株和肝癌组织内的表达8第二部分：AG01对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力及P53与VEGF表达的影响16第三部分：AG01与肝癌新生血管生成关系的验证及其预后价值的研究......32誠45参考文献46文献综述Argonaute蛋白家族与肿瘤的研究进展52发表论文60mM62AG01影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究AGOl影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究中文详细摘要原发性肝癌主

3、要是肝细胞癌（以下简称肝癌），其发病率位居全球恶性肿瘤发病率第5位，而肿瘤致死率则位居全球第3。目前，外科根治性切除是治疗肝癌的主要方法，但其术后高复发率和高转移率是阻碍肝癌患者获得长期生存的主要问题。因此探索新的有效生物指标来进行预后判断或者作为靶点发展新的辅助治疗手段，成为预防及治疗肝癌复发转移的重要研究方向。越来越多的研究已经显示微小RNA(microRNAs,miRNAs)可以通过RNA干扰（RNAinterference,RNAi)途径调节很多细胞内的基因表达。其中有半数miRNAs位于较为脆弱的染色

4、质位点以及那些经常在各种肿瘤内功能丢失或功能放大的区域，提示了这些miRNAs可能在肿瘤发生发展中起重要作用，他们也被称为肿瘤miRNAs(oncomiRs)。然而，虽然在肿瘤发生发展过程中抑制这些oncomiRs可以成为一种新型有效的肿瘤疗法，但由于每种oncomiR对于肿瘤发展所起的作用是各自独立的，因此在肿瘤细胞中同时抑制多种oncomiR是极为困难的。而AGO亚家族是Argonaute蛋白家族的两个亚家族（AGO和PIWI)之一，是RNAi机制的必需组成蛋白，同时也可以调节大多miRNAs的生物合成。这

5、些蛋白出现在已被报道的所有RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplexes,RISC)中，并且被认为是在成熟miRNAs生物合成过程中的必需蛋白。作为RISC的主要成分蛋白，AG01的研究较为深入，其与多种肿瘤的关系已经在近期多个研究中被报道。然而，在肝癌研究中仅有有限的关于AG01的数据被报道且并未得出任何结论。因而，相比较单个miRNAs而言，探索AG01和肝癌之间的联系可能是寻找肝癌有效预后指标和治疗靶点的一个更有希望的途径。因此我们对其进行了系统研究。我们利用RT-PCR

6、和WesternBlot方法检测人不同转移潜能肝癌细胞株HepG2、MHCC97L及HCCLM3内的AG01表达情况，同时利用RT-PCR方法检测其在冰冻肝癌标本及相应癌旁组织标本内的表达情况，发现AG01的表达随着肝癌细胞株转移潜能的增加而增加（尸=0.014),并且在肝癌组织内的表达显著高于其相应的癌旁组织（尸<0.001)。为进一步探索AG01在肝癌中所起的作用以及其可能的内在机制，我们设计并合成不同抑制效率的AGOl靶向siRNA:controlsiRNA、AGO1-2427和AGOl-2235,并将它

7、们转染入HCCLM3与HepG2两种肝癌细胞株。在siRNA转入24h后，RT-PCR和WesternBlot检测证实细胞内AGOl表达的抑制效率随AG01影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究controlsiRNA,AG01-2427和AG01-2235表现出显著提高的趋势，且三者之间有显著差异(P=0.003和P<0.001)。AG01的下调造成细胞增殖功能在转染siRNA48h后出现显著抑制（P=0.039和尸=0.014)。同样，在划痕实验与Transwell小室侵袭实验中，抑制AG01表达也造

8、成了肿瘤细胞迁移与侵袭能力的显著下降（均为/><0.001)。且在该两种细胞株功能实验中，细胞增殖、迁移与侵袭能力的抑制随着controlsiRNA、AGO1-2427和AG01-2235表现出显著提高趋势。AG01的下调也同样导致了该两种细胞株P53和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的显著下降（均为_P<0.001)，且