hescs和hipscs向红细胞分化的dna甲基化谱分析及oct4诱导hhfmscs向红细胞分化

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1、前言前言红细胞生成受体内造血微环境和造血相关基因的严密调控，但是对于人多潜能干细胞产生单一谱系红细胞的机制尚不清楚。目前认为，红细胞生成过程受表观遗传学和遗传学双重调控。其中DNA甲基化作为表观遗传学最重要的修饰方式，通过调控基因组表达动力学及红细胞生成相关的转录因子介导其靶基因表达，从而诱导干细胞向红细胞分化。人胚胎干细胞（humanembryonicstemcells，hESCs）虽然涉及伦理问题，但在体外向成年型红细胞分化效率高，而人类人工诱导多潜能干细胞（humaninducedpluripotentstemcells，hiPSC

2、s）虽然体外产生红细胞的效率低，但可回避hESC的伦理问题。因此，hESCs和hiPSCs作为最具潜能的种子细胞广泛应用于体外红细胞生成的研究中。利用DNA甲基化芯片和全基因组表达谱芯片技术研究hESCs和hiPSCs向红细胞分化的分子机制，有利于揭示红细胞生成过程中发育阶段依赖性的基因表达动力学的表观遗传学原理，并为优化体外干细胞向红细胞分化的研究提供新思路。近期研究发现，应用多潜能性转录因子可以实现不同细胞类型之间的转分化，其中OCT4作为最重要的重编程因子，单独转导靶细胞可以避开hiPSC未分化的细胞阶段，实现其他细胞类型向红细胞直

3、接转变，从而为体外红细胞生成提供新的思路，为患者个体化细胞治疗提供新途径。为了研究人多潜能干细胞向红细胞分化的机制及OCT4诱导人毛囊间充质干细胞（humanhairfolliclemesenchymalstemcells，hHFMSCs）向红细胞分化中的作用，本论文进行以下三方面的研究：hESCs向红细胞分化中DNA甲基化谱与基因表达谱的负相关分析；iPSCs向红细胞分化中DNA甲基化谱与基因表达谱的负相关分析；OCT4诱导hHFMSCs向红细胞分化的作用。I中文摘要hESCs和hiPSCs向红细胞分化的DNA甲基化谱分析及OCT4诱导

4、hHFMSCs向红细胞分化红细胞生成过程受表观遗传学和遗传学双重调控，其中DNA甲基化作为表观遗传学的重要机制，通过调控基因组表达动力学及红细胞生成相关转录因子诱导干细胞向红细胞分化。本论文利用DNA甲基化芯片和全基因组表达谱芯片技术，分析hESCs和iPSCs向红细胞分化过程中DNA甲基化谱和基因表达谱的改变，并通过负相关基因的分析探讨多潜能干细胞向红细胞分化中DNA甲基化的作用机制；同时研究OCT4诱导hHFMSCs直接向红细胞分化的作用。一、hESCs向红细胞分化中DNA甲基化谱与基因表达谱的负相关分析利用DNA甲基化芯片和基因表达

5、谱芯片技术，对hESC（人胚胎干细胞）、hES-EB（由hESC获得的中胚层祖细胞群）以及hES-BL（由hES-EB分化的红系细胞）三种细胞样本进行分析，筛选差异甲基化CpG（differentiallymethylatedCpG，DMC）位点及差异表达基因，联合分析DNA甲基化与基因表达呈负相关的基因，利用GO分析富集基因功能，用KEGG分析富集信号通路，用GeneSpring软件构建调控网络，最后用real-timeMSP和RT-qPCR验证芯片结果。实验结果如下：1.hESC向红细胞分化中DNA甲基化谱的分析（1）hES-EB与h

6、ESC相比共有639个DMC位点；hES-BL与hESC和hES-EB相比，DMC位点分别为100991个和134736个。高甲基化CpG位点主要富集于CpG岛岸和CpG岛及启动子区，低甲基化CpG位点主要富集于CpG岛shelf和opensea及转录区，二者在编码RNA序列的分布比例没有明显差别。（2）GO分析显示，hESC向hES-EB分化中，DMC位点所在基因主要参与GTP酶介导的信号转导、细胞形态的调节及特异性基因转录；hES-EB向hES-BL分化中，DMC位点所在基因主要参与心血管发育、造血和淋巴器官发育等。（3）KEGG分析

7、显示，hESC向hES-EB分化中，DMC位点所在基因参与III黏着斑、II型糖尿病和肌动蛋白细胞骨架的调节等通路；hES-EB向hES-BL分化中，DMC位点所在基因主要参与黏着斑、细胞粘附分子和钙离子信号通路等。2.hESC向红细胞分化中基因表达谱的分析（1）hES-EB和hESC比较，共有810个差异表达基因，hES-BL与hESC和hES-EB相比，差异表达基因分别为5264个和5843个。（2）GO分析显示，hESC向hES-EB分化中上调基因与循环系统发育相关；下调基因参与细胞粘附和神经发育。hES-EB向hES-BL分化中上

8、调基因参与造血、红细胞发育与成熟过程；下调基因参与神经系统和胚胎发育。（3）KEGG分析显示，hESC向hES-EB分化中上调基因参与TGF-β、癌症和凝血等相关信号通路；下调基因未富集到相关