弓形虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其对犬的免疫效果

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1、弓形虫Rhomboid基因重组卡介苗的构建及其对犬的免疫效果DevelopmentofrecombinantBCGofToxoplasmagondiiRhomboidgeneanditsimmuneeffectofcanine作者姓名：罗文武罗文武领域（方向）：兽医指导教师：张西臣教授类别：兽医硕士答辩日期：2015年6月6日本项目由国家公益性行业（农业）科研专项（201303042）和吉林省科技发展计划项目资助（20130206023NY）。ThisworkwassupportedbythegrantfromtheSpecialFundforAgro-scientif

2、icResearchinthePublicInterestinChina(no.20130304)andfromtheDepartmentofJilinProvincialScienceandTechnologyofChina(No.20130206023NY).中文摘要弓形虫Rhomboid基因重组卡介苗的构建及其对犬的免疫效果刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是呈世界分布的寄生性原虫。弓形虫广泛寄生于人体及其它所有温血动物体的有核细胞内，可引起严重的人兽共患寄生虫病，给人类健康和畜牧业的生产带来严重的威胁。由于在弓形虫病防治方面没有理想的药物和疫苗，所以

3、研制安全、有效的疫苗成为预防弓形虫病的工作重点。目前弓形虫基因工程苗所候选抗原基因主要有SAG1，SAG2，P28，P23，微线粒体抗原，侵入促进因子(PEF)，54ku膜蛋白，致密颗粒抗原等。如今Rhombiod已经成为弓形虫疫苗候选基因和化药研究靶位的研究热点。IL-2是机体免疫调节网络中发挥重要作用的细胞因子。目前，关于犬白介素2（IL-2）重组卡介苗预防弓形虫病未见报道，因此本研究通过构建犬白介素2以及弓形虫Rhomboid重组卡介苗、免疫犬，检测其临床免疫效果，为深入研究犬弓形虫疫苗奠定理论基础。犬IL-2基因的克隆及序列分析提取犬脾脏RNA，根据NCBI中G

4、enebank报道的犬IL-2基因序列及载体中所含酶切位点设计引物。通过反转录PCR扩增出犬IL-2基因开放阅读框，并将其连接到pMD18-T载体中，测序结果经Blast比对显示PCR扩增出的465bp基因开放阅读框与原序列同源性为100%。重组质粒pMV2(3)61-IL2-Rho在卡介苗中的表达及鉴定将鉴定正确的犬IL-2基因和弓形虫Rhombiod基因一起插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体和整合表达载体中，构建重组质粒pMV261-IL2-Rho和pMV361-IL2-Rho，并将其转入卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传代培养。45℃热诱导目的蛋白表达

5、后，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，结果表明成功构建了含有犬IL-2和弓形虫Rhomboid基因的穿梭表达载体pMV261-IL2-Rho和整合表达载体pMV361-IL2-Rho，Rhomboid基因在结核杆菌表达系统中可以进行稳定表达，并具有良好免疫原性，为进一步研制弓形虫rBCG奠定了基础。重组卡介苗pMV2（3）61-IL2-Rho对犬弓形虫感染的免疫效果将构建II成功的重组卡介苗pMV261-IL2-Rho和pMV361-IL2-Rho以及pMV261-Rho和pMV361-Rho分别经皮下免疫犬，检测体液以及细胞免疫水平。结果显示，各免

6、疫组抗体水平随免疫次数增加而上升，重组卡介苗pMV261-IL2-Rho和pMV361-IL2-Rho免疫组与对照组差异极其显著。Th1型和Th2型细胞因子进行检测，随着免疫次数增加，各试验组血清IL-2、IFN-γ水平呈上升趋势，但PBS对照组、BCG对照组没有明显变化。检测IL-4水平发现，所有组在免疫过程中，变化不明显。免疫组TNF-α浓度变化与对照组比较差异极其显著。体温检测显示，各免疫组犬的体温较对照组变化波动小，存活时间有一定的延长，检测血液里虫体数量情况发现，重组卡介苗对弓形虫的攻击有一定的免疫效果，IL-2增强重组卡介苗的免疫效果。关键字：弓形虫，Rho

7、mboid，白介素2，rBCGIIIAbstractDevelopmentofrecombinantBCGofToxoplasmagondiiRhomboidgeneanditsimmuneeffectofcanineToxoplasmagondii,anobligateintracellularprotozoanparasite,isfoundworldwide.Itinfectsawiderangeofwarm-bloodedanimalsandcancauseseverezoonoticparasitestotheproductio