试析天然水蛭素分离纯化研究

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1、广西大学硕士学位论文天然水蛭素分离纯化研究姓名：林晓洋申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：童张法;雷爱祖20070418天然水蛭素分离纯化研究摘要水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中所含的一种蛋白质，是迄今世界上已发现的最强的凝血酶特效抑制剂，是一类很有前途的抗凝化瘀药物。世界各地科学家都在研究水蛭素，有很多关于水蛭素的报道和专利，但以前人们关于水蛭素提取的报道大多数都要杀死整条水蛭来获得水蛭素，本实验以南宁科康生物有限公司养殖的菲牛蛭的提取物为原料，将其分离纯化条件进行优化，以获得活性更高的水蛭素产物。实验首先是比较了硫酸铵分级沉淀盐析法、有机溶剂沉淀法和pH沉淀法

2、三种蛋白质沉淀法对水蛭素分离纯化的效果，确定了利用硫酸铵分级沉淀盐析对水蛭唾液分泌物进行粗分离纯化，通过多次离心分段盐析和两次离心分段盐析效果表明：35％～55％饱和度的(NH4)2S04(w。)是较理想的盐析范围，通过正交实验确定了最佳的正交实验条件为：40％饱和度的(NH4)2S04，pH为5．5，静置时间为20min，此时蛋白质的回收率(wp)：34．37％，水蛭素活性回收率(Wh)=69．33％，水蛭素纯化倍数(风p)：_2．02，比活(S。)=5．33AT-U／mg。在中间纯化和精制过程中，比较了DEAESephadexA．50和DEAESepharos

3、eCL．6B两种离子交换层析树脂的分离纯化效果，确定利用DEAESepharoseCL-6B作为离子交换层析法的树脂对水蛭素进行进一步的分离纯化。在以DEAESepharoseCL一6B柱层析纯化优化实验中，考察了不同缓冲液、离子洗脱浓度、上样量及洗脱速度等因素对水蛭素分离T纯化效果的影响，得知在0．025mol／mL磷酸盐缓冲液，o~1．0mol／LNaCl的离子洗脱浓度，上样量为100mL，洗脱速度为30mL／h的条件下蛋白质的回收率=5．07％，水蛭素活性回收率=77．76％，水蛭素纯化倍数(Rhp)=15．34，比活(Sp)=191．69AT-U／mg。在

4、以SephadexG-25凝胶树脂的柱层析脱盐优化实验中考察了洗脱速度因素对水蛭素分离纯化效果的影响，得知在30mL／h的洗脱速度的条件下蛋白质浓度=0．295p．g／mg，蛋白质的回收率=O．27％，水蛭素活性回收率----47．88％，水蛭素纯化倍数(凡。)=8．73，比活(S。)=1017AT-U／mg。最后利用高效液相色谱(HPLC)对其进行了进一步的分离和检测，集中收集活性峰，检测其纯度在90％以上。另外，用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了收集到的水蛭素溶液的分子量分布情况并验证了其纯度。天然水蛭素具有活性高、结构稳定、不易失活以及后期纯化成本低等特点，

5、是开发抗凝、溶栓新药的理想原料。在接下来的研究工作中，我们将纯度较高的水蛭素溶液进行冷冻干燥，做进一步的制备和鉴定。关键词：水蛭素分离纯化工艺条件ⅡSTUDYONTHEISOLATIoNANDPIⅡtIFICATIONOFNATRUAL唧己UDINFROMLEECHABSTRACTHimdin。舔anovelanticoagulantandantithromoticagent，isakindofproteinthatisobtainedfromthesalivaryglandsecretionofonekindblood—suckingleech．Nowthesc

6、ientistsallovertheworldhaveintensivelyinvestigatedtheisolationandpurificationofhirudin．Buttheleechwaskilledinordertoobtainhirudininmostmethodsofextractinghirudinfromleechinthesepapersandpatents．Thiswillincreasethecost．Sohirudin’SclinicalHSeremainedlimitbecausethissubstanceWasnotavaila

7、bleinadequateamountsfortherapeuticpurpose．Thethreemethodsofsalting-outwith(Nt-h)2S04saturation，precipitatingwithorganicimpregnantandchangingpHofproteininisolatingandpufffyinghirudinwerestudiedfirstly，anditiscertainthatthemethodofammoniumsulfatesalting-outtoisolatehirudinistheprimaryst

8、ep．Th