蝗绿僵菌gtpase激活蛋白基因gyp3的功能研究

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1、蝗绿僵菌GTPase激活蛋白基因Gyp3的功能研究重庆大学硕士学位论文(学术学位)学生姓名：周志敏指导教师：夏玉先教授专业：药学学科门类：理学重庆大学生命科学学院二O一五年四月FunctionalanalysisofGTPase-activatingproteingeneGyp3inMetarhiziumacridumAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’sDegreeofScienceByZhiminZhouSupervisedbyProf.Yuexia

2、nXiaSpecialty:PharmacyCollegeofLifeSciencesofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaApril,2015重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要绿僵菌是一类重要的昆虫病原真菌，具有生防菌株的共有优点；同时由于其宿主广泛而成为研究昆虫病原真菌的模式生物。绿僵菌在日常生产生活施用中也存在诸多制约因素，比如受环境影响大、杀虫速度较慢等。因此对影响昆虫病原真菌毒力和抗逆境能力的基因进行研究并以此为突破口改良菌株，能为真菌农药的开发利用提供重要的理论基础。研究表明GYP3通过抑制Rab5家族蛋白活性从而降低GTP水解速率，在病原真

3、菌中并没有对该蛋白的研究报道。同时在病原真菌中研究发现该类蛋白的靶蛋白Rab5家族对致病真菌的正常生长，毒力和抗逆境能力都至关重要；有报道称Rab5家族在压力条件下发挥作用时需要Rab5GAP蛋白的参与，那么GYP3或许可以通过调控Rab5家族活性从而实现对菌株毒力和抗逆境能力等方面的影响，所以本研究为发现Gyp3基因在昆虫病原真菌中的功能及作用机制提供了理论证据，同时这也有利于利用分子生物学与基因工程等手段实现对绿僵菌菌株的改良。本文以绿僵菌作为实验材料，通过对该基因敲除及回复明确该基因功能分析其作用机制。主要研究结果如下：+1、Gyp3降低绿僵菌对Na和对湿热以及紫外辐射（UV-B）

4、的耐受能力：在加入Nacl的1/4SDA固体培养基上，敲除转化子菌落大小明显小于野生型和回复转化子；随着UV-B和热激时间的增加，ΔGyp3与WT和CP相比萌发率显著降低。2、Gyp3不调控绿僵菌产孢量，孢子附着胞形成率及对细胞壁破坏剂耐受性：在加入细胞壁破坏剂的1/4SDA固体培养基上，敲除转化子菌落大小与野生型和回复转化子相比无明显差异。通过测量统计，ΔGyp3的产孢量和孢子附着胞形成率与WT和CP相比降低无显著差异。3、Gyp3通过影响绿僵菌在东亚飞蝗体表的萌发率、膨压及附着胞水解体壁水解酶的表达、在寄主昆虫血淋巴中的生长等过程调控其毒力：通过测量统计，ΔGyp3的萌发率、膨压及附

5、着胞水解体壁水解酶的表达与WT和CP相比显著降低；抑制在寄主昆虫血淋巴中的生长。4、Gyp3可以通过调控靶蛋白家族Rab家族的表达，进而实现对Rab蛋白活性的抑制：通过测量统计，ΔGyp3的靶蛋白家族Rab家族的表达与WT和CP相比显著降低。关键词：绿僵菌，GTP酶活化蛋白，抗逆境能力，Rab，毒力I重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTMetarhiziumanisopliaeisoneofthemostimportantgeneralofentomopathogenicfungi,ithasagreatpotentialasbiocontrolagentsduetoitsenv

6、ironmentalsafetyandlowlikelihoodofthedevelopmentofinsectresistance.Inaddition,thewideoccurrenceanditsbroadspectrumofactionmakeithasbeenbecomeaveryimportantmodelorganismsforstudyinfectionprocessinarthropods.Nevertheless,someshortcomingshavehinderitwidespreadapplication,suchassensitivitytovariousad

7、versitesandlowinsecticidalspeed.Betterunderstandingongenewhichinfluencevirulenceandcellularstressescouldmakeimprovestraincometrueandalsoprovidesanimportanttheoreticalbasisoffungalpesticides.GYP3isaprincipalRab5GAP(GTPa