蝗绿僵菌cqma102体表入侵相关基因machy的克隆和分析

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1、蝗绿僵菌CQMa102体表入侵相关基因MaChy的克隆和分析重庆大学硕士学位论文学生姓名：姚秀清指导教师：夏玉先教授专业：生物学学科门类：理学重庆大学生物工程学院二O一一年十一月CloningandFunctionalAnalysisofMaChygeneinMetarhiziumacridumAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceByXiuqingYaoSupervisedbyProf.YuxianXiaMa

2、jor:BiologyCollegeofBioengineeringofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaNov.2011重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要蝗绿僵菌（Metarhiziumacridum）是一类应用广泛的虫生真菌，在农业害虫生物防治中起着重要作用。虫生真菌的致病力是影响其广泛使用的主要限制因素，迄今为止，实验室在前期工作中构建了蝗绿僵菌CQMa102在侵染过程中，相比于体内，在体表时期的高表达的差减文库，从此文库中，选择了蝗绿僵菌CQMa102体表时期高表达的一条EST序列，该EST序列长750bp，经过比对发现该序列与其他

3、物种中的氰化物水合酶的同源性较高。利用本实验室构建的蝗绿僵菌CQMa102在产孢时期的均一化全长cDNA文库，获取了该基因（MaChy）的cDNA全长。通过以基因组为模板PCR扩增后克隆测序的方式，成功获取了MaChy基因的DNA全长。利用RNAi的方法研究了MaChy的功能。主要研究结果如下：①获得了MaChy基因的cDNA全长，并进行了相关生物信息学分析。MaChy基因cDNA序列全长为1202bp，5’端有80bp的UTR区域，3’端有50bpUTR区域，其开放阅读框为1074bp。预测该基因编码357个氨基酸，与多个物种如eptosphaeriamaculans(A

4、AF66098.1)、Aspergillusniger(XP_001389844.1)、Fusariumsolani(CAM82815.1)、Neurosporacrassa(XP_960160.2)、PenicilliumchrysogenumWisconsin(XP_002562104.1)、Aspergillusniger(ABX75546.1)、Alternariabrassicicola(AAP88966.1)对应所编码都有97%以上的蛋白同源性。该蛋白没有信号肽，也不具有跨膜的结构。②生物信息学分析结果显示，该蛋白的分子量39.78kDa,等电点为5.53。为酸

5、性蛋白。预测其在177位（NASK）、206位（NASE）、332位（NSTD）氨基酸处存在N-糖基化位点；4位（TIR）、77位（SMR）、300位（TKK）、323位（TPK）氨基酸处存在蛋白激酶C磷酸化位点；104位(SELD)、134位（THVE）、179位（SKHE）、341（STLE）处有一个酪蛋白激酶2磷酸化位点；122位（GTVINH）、144位（GSGDSL）、238位（GARLGL）、262位（GNGYSR）N-十四酰化位点。③通过PCR扩增基因组送测序后，获取了MaChy基因的DNA全长，将DNA序列与cDNA序列用DNAMAN软件比对，结果显示：Ma

6、Chy基因不含内含子，DNA全长1202bp。④采用RNAi的方法进行MaChy基因的功能研究。构建MaChy基因的农杆菌介导法转化的RNA干扰载体后，通过农杆菌介导的方法转化蝗绿僵菌CQMa102中，经过培养基的初筛和PCR筛选后，获得多个稳定的MaChy基因干扰突变株。⑤分析了MaChy基因干扰突变株的毒力变化，统计分析发现干扰突变株和出发菌株的半数致死时间没有显著差异，推测MaChy基因的功能与毒力不相关。I重庆大学硕士学位论文中文摘要⑥观察干扰突变株与出发菌株在附着胞形成方面的差异，从多个角度进行统计分析，在附着胞形成比率，形成时间，附着胞形态，附着胞大小都没有显著

7、的差异。⑦分析了MaChy基因在体表和体内的表达差异。统计定量PCR数据得到的结论显示，在体表阶段的表达量最高，大约是体内表达量的2.5倍，而在1/4SDA液体培养基中的表达量与体内表达量基本相同，表明该基因在体表阶段是高表达的。关键词：绿僵菌，MaChy基因，RNAi，干扰突变株II重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTTheascomycetesMetarhiziumacridumwaswellcharacterizedentomopathogenicfungiandwidelyusedinbiologi