棉花逆境响应相关nac类转录因子的克隆与分析

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1、分类号：密级：无学号：2012103023单位代码：10759石河子大学硕士学位论文棉花逆境响应相关NAC类转录因子的克隆与分析学位申请人赵灿指导教师朱新霞副教授刘任重研究员申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称遗传学研究方向植物分子遗传学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月TheCloneandAnalysisofStressResponseRelatedNACTranscriptionFactorsinCottonADissertationSubmittedtoShihezi

2、UniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByZhaocan(BotanicalMolecularGenetics)DissertationSupervisor:AssociateProfessor.ZhuXin-xiaProfessor.LiuRen-zhongJune,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明摘要干旱、盐、病害等逆境胁迫严重影响着植物正常的生长

3、发育，进而制约着作物产量。植物在漫长的进化过程中，通过感知逆境信号，调控抵御逆境的相关基因表达变化，形成了诸多在逆境胁迫下的保护机制。NAC转录因子为植物所特有，目前对拟南芥、水稻等植物NAC基因的研究表明，NAC基因在植物生长发育，器官形成，植株衰老，激素信号传导及逆境胁迫应答中发挥着重要作用。目的：在亚洲棉全基因组中预测分析NAC基因，进一步开发棉花NAC基因资源；克隆获得陆地棉NAC转录因子，研究其在干旱、盐、病害等逆境胁迫下的表达，分析其转录活性，为揭示棉花NAC转录因子在响应逆境胁迫中

4、的作用奠定基础方法：利用生物信息学方法预测亚洲棉全基因组的NAC基因；采用RT-PCR方法克隆GhSNAC5和GhSNAC8基因；采用实时荧光定量PCR技术分析基因在干旱、盐、病害等逆境胁迫下的表达；通过构建酵母转录激活载体和亚细胞定位载体分析基因的转录因子活性；采用基因工程方法构建GhSNAC5和GhSNAC8基因的植物表达载体；通过农杆菌介导法转化烟草。结果：在亚洲棉全基因组中预测了138个NAC基因，根据GaNAC蛋白的序列相似性及系统进化分析，将其分为11个亚家族，每个亚家族的GaNAC

5、蛋白数目为4-25个。基因结构分析发现，63.7%的GaNAC基因含有2个内含子。GhSNAC5基因的cDNA序列长度为1080bp，其开放阅读框（ORF）编码299个氨基酸。GhSNAC8基因的cDNA序列长度为1104bp，其开放阅读框（ORF）编码349个氨基酸。2个基因所编码的蛋白序列在N-末端均含有NAM保守域。对基因结构分析发现GhSNAC5和GhSNAC8基因分别各含有3个外显子2个内含子，且内含子具有典型的植物内含子特征。利用荧光实时定量PCR分析了GhSNAC5和GhSNAC8

6、基因受高盐、干旱及黄萎病胁迫处理后的表达变化。结果显示，GhSNAC5和GhSNAC8基因在受到干旱处理2h后，表达明显上调，24h后呈现下降态势；GhSNAC5和GhSNAC8基因在受到高盐处理2h后，表达量明显上调。GhSNAC5基因在高盐胁迫12h后，相对表达量上调了50倍，这说明GhSNAC5基因在响应盐胁迫时，具有高表达性。GhSNAC5和GhSNAC8基因在受到黄萎病VD8处理6h后，相对表达量明显上升，比受干旱及盐处理的响应时间要延后。通过构建酵母转录激活载体对GhSNAC5和Gh

7、SNAC8基因的转录激活活性进行了试验，缺失培养生长情况及β-gal显色结果显示，GhSNAC5和GhSNAC8基因均能转录激活下游基因的表达。利用pBI221-GFP载体将GhSNAC5和GhSNAC8与GFP构建融合蛋白，瞬时表达试验结果显示，GhSNAC5和GhSNAC8均定位与细胞核内。利用pCAMBIA3301及pROKⅡ构建了一个新载体，与GhSNAC5和GhSNAC8基因重组构建了植物过表达载体，并成功转化至烟草。结论：通过比较亚洲棉与陆地棉、雷蒙德氏棉NAC蛋白的同源性，发现亚洲

8、棉与雷蒙德氏棉NAC蛋白的匹配程度高于陆地棉，为亚洲棉及陆地棉NAC转录因子的后续深入研究提供了重要参考。本研究从陆地棉中克隆并分析了两个NAC基因GhSNAC5和GhSNAC8，为GhSNAC5和GhSNAC8基因功能的深入研究奠定基础，并为棉花的遗传改良提供了基因资源；关键词棉花，NAC转录因子，克隆，表达，逆境胁迫IAbstractAdversitystressesasdrought,salinity,diseasesseriouslyaffectthenormalgrowthanddev