氮素营养对水稻分蘖基因表达特性及根系和抗倒性的影响

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中閣分类号Ｓ５１１学校代码１０２２４．密级公开学号１２０３１０１５１是＾袭聲／、聲硕女学位论文氮素营养对水稻分藥基因表达特性展樞系和抗倒性的影响作者部冠化导师金正就教掠学位类别农学硕±所在学院农学院￣－级学科作物学二级学科作物遗传育种二〇—五年六月 独创声明本人声明所呈交的学位化文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的巧究成ｌ果。据我所知，除了文中特别加ｉｕ示注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（巧＝化巧有其他需要特别声明的，本栏可巧）或其他教肯机构的学位或证书使用过的村料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何责献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学？＇如日期；阀狂ｅ／学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有巧保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和撼盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可＾＾将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行拉索，可＾＾＾采巧影印、缩巧或扫描等复制手段保存。（、汇编学位论文保密的学位论文在解巧后适用本授权书）学位论文作者签名日期／广年月以０：灰／＾ＳＳ名如知曰期：兴年／月三曰 ClassifiedIndex：S511Code：10224Confidential(yes/no)：noNO.：120310151DissertationfortheMasterDegreeEffectoftheNitrogenNutritiononCharacteristicsofRiceTilleringGeneandRootandLodgingResistanceCandidate:ZhengGuanlongSupervisor:Professor.JinZhengxunDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:AgriculturalcollegeFirstleveldiscipline:CropScienceSecondleveldiscipline:CropGeneticsandBreedingHarbinChinaJune2015 目录目录摘要...................................................................................................................................................II英文摘要.........................................................................................................................................III1引言...............................................................................................................................................11.1水稻分蘖研究动态和趋势.....................................................................................................11.1.1环境对分蘖的调控............................................................................................................11.1.2激素对分蘖的调控............................................................................................................21.1.3基因对水稻分蘖的调控...................................................................................................21.2水稻根系研究概况................................................................................................................21.2.1根系活力..........................................................................................................................31.2.2根系形态..........................................................................................................................31.3产量及产量因素....................................................................................................................41.3.1N肥与水稻产量................................................................................................................41.3.2N肥的合理施用................................................................................................................41.4水稻抗倒伏特性的研究与概况.............................................................................................51.4.1水稻倒伏与预防...............................................................................................................51.4.2N素与水稻倒伏关系........................................................................................................51.4.3其他元素与水稻倒伏的关系...........................................................................................51.5研究目的与意义....................................................................................................................61.6研究内容.................................................................................................................................62材料与方法...................................................................................................................................72.1供试材料................................................................................................................................72.2试验方法................................................................................................................................72.3伤流液收集方法....................................................................................................................72.4考种........................................................................................................................................82.5茎秆抗倒性测定....................................................................................................................82.6植株茎秆全氮测定方法........................................................................................................82.7分蘖基因mRNA表达量测定...............................................................................................82.7.1试剂.................................................................................................................................82.7.2序列获取..........................................................................................................................82.7.3引物设计..........................................................................................................................82.7.4水稻茎秆基部总RNA提取............................................................................................92.7.5逆转录..............................................................................................................................92.7.6筛选最佳退火温度........................................................................................................102.7.7PCR反应........................................................................................................................10I 东北农业大学农学硕士学位论文2.8统计分析方法....................................................................................................................103结果与分析...............................................................................................................................113.1不同品种及处理间产量及产量构成因素比较.................................................................113.2不同品种及处理对分蘖及生物量的影响........................................................................123.3不同类型品种及不同施肥处理影响分蘖基因转录表达比较.........................................133.3.1RNA完整性及定量检测..............................................................................................133.3.2基因RT-PCR引物验证..............................................................................................143.3.3水稻生长过程中分蘖基因mRNA表达量变化动态..................................................143.3.4不同施肥处理对分蘖基因mRNA表达量的影响.....................................................163.4不同品种及处理间根系形态的比较................................................................................183.4.1品种及处理间根系体积与长度比较..........................................................................183.4.2品种及处理间根系重量比较......................................................................................193.4.3不同类型品种根系各部分比重的差异......................................................................213.5不同品种及处理间根系活力比较.....................................................................................233.6不同品种及施肥方法对抗倒性的影响.............................................................................254讨论...........................................................................................................................................284.1关于水稻分蘖基因表达特点及氮素响应.........................................................................284.2关于水稻根系生长特点及其与氮素营养关系.................................................................284.3N素营养对水稻产量及产量构成因素的影响..................................................................294.4生育前后期N素营养与水稻抗折力的关系....................................................................295结论..........................................................................................................................................31致谢..............................................................................................................................................32参考文献......................................................................................................................................33攻读硕士学位期间发表的学术论文...........................................................................................39II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese...............................................................................................................................IAbstractinEnglish.............................................................................................................................III1Introduction........................................................................................................................................11.1Studyondynamicandtendencyofricetillering.............................................................................11.1.1Environmentalregulaionoftillering........................................................................................11.1.2Regulationofplanthormonesontiller.....................................................................................21.1.3regulationofgeneofricetillering............................................................................................21.2Thegeneralsituationofresearchonricerootsystems...................................................................31.2.1Theactivityofroot...................................................................................................................31.2.2Themorphologyofroot...........................................................................................................31.3Yieldandyieldfactors...................................................................................................................41.3.1Nitrogenfertilizerandriceyield..............................................................................................41.3.2Reasonableapplicationofnitrogenfertilizer............................................................................41.4Researchandsurveyofthecharacteristicsoflodgingresistanceofrice........................................51.4.1Lodgingandpreventionofrice................................................................................................51.4.2Therelationshipbetweennirtogenandricelodging..................................................................51.4.3Therelationshipbetweenotherelementsandlodging..............................................................61.5Thepurposeandsignificanceofresearch......................................................................................61.6Studycontentsofthisexperiment..................................................................................................62Materialsandmethods......................................................................................................................72.1Thetestedmaterials.......................................................................................................................72.2Testmethod...................................................................................................................................72.3Thesamplingmethod.....................................................................................................................72.4Test................................................................................................................................................82.5Determinationoflodgingresistanceofstem..................................................................................82.6Methodfordeterminationoftotalnitrogeninplantstalks..............................................................82.7DeterminationoftilleringexpressionfogenemRNA..................................................................82.7.1Reagent....................................................................................................................................82.7.2Sequenceacquisition................................................................................................................82.7.3Designoftheprimer................................................................................................................82.7.4ExtractionoftilleringgeneRNA.............................................................................................92.7.5Reversetranscriptase...............................................................................................................92.7.6Screeningofoptimumannealingtemperature........................................................................102.7.7PCRreaction..........................................................................................................................102.8Themethodofstatisicalandanalysis.........................................................................................10III 东北农业大学农学硕士学位论文3Theresultsandanalysis...................................................................................................................113.1Differentvarietiesandtreatmentbetweenyieldandtieldcomponentsofcomparison................113.2Differentcultivarsandtreatmenteffectontilleringandbiomass................................................123.3Comparisongofexpressionofdifferentvarietiesanddifferentfertilizatongeffetoftilleringgenetranscription...............................................................................................................................133.3.1RNAintegrityandquantitativedetection...............................................................................133.3.2RT-PCRgeneprimerverification...........................................................................................143.3.3DynamicchangesingeneexpressionquantityofmRNAofdifferentvarietiesoftilleringindifferentperiods........................................................................................................143.3.4IndifferentperiodsofdifferentvarietiesoftilleringgenemRNAexpressionamountchangecomparison..........................................................................................................................163.4Comparisonofdifferentvarietiesandtreatmentsofrootmorphology.........................................183.4.1Thecomparisonofrootvolumeandlengthofvarietiesandtreatments.................................183.4.2Rootweightcomparisonbetweenvarietiesandprocessing...................................................193.4.3Differencesofrootindifferentvarietiesoftheproportionofeachpart.................................213.5Comparisonofrootactivityindifferentvarietiesandtreatments................................................233.6Effectsofdifferentvarietiesandfertilizationmethodsagainstthebackofthe............................254Discussion.........................................................................................................................................284.1OnRiceTilleringgeneexpressioncharacteristicsandnitrogenresponse....................................284.2Onthecharacteristicsofricerootgrowthanditsrelationshipwithnitrogennutrition................284.3Nitrogennutritioncomponentfactorsofyieldandyieldofrice..................................................294.4Relationshipbetweenbirthearlythelatenitrogennutritionandthefractureresistanceofrice...295Concluson.........................................................................................................................................31Acknowledgement...............................................................................................................................32References............................................................................................................................................33PaperspublishedintheperiodofPh.M.education..........................................................................39VI 摘要摘要近几十年，为了提高水稻的产量，人们越来越多地增加肥料的投入，特别是氮肥的投入。氮肥在水稻生产中的用量不断增加，已造成很大的环境污染和资源浪费。可以说水稻依赖于施用氮素化肥所获得的增产实际上是以消耗能源和污染环境为代价所取得的。结果既提高了水稻生产成本，也招致水土严重污染破坏生态平衡，阻碍水稻生产的可持续发展。不合理的氮肥施用方法更加剧了氮肥的投入量和资源的浪费以及水土污染。为此，本试验选用寒地穗数型中晚熟高产品种松粳6号号和穗重型晚熟超级稻品种松粳9号号，在统一施氮量不同施肥方式条件下，比较分析水稻产量构成因素、分蘖基因表达特性，水稻根系形态和活力、茎秆抗倒性状等变化动态，旨在明确氮肥施用方法与上述诸多性状变化间的关系，为确立寒地水稻高产高效减氮环保型栽培技术提供理论依据。研究结果表明：水稻生育前期和后期施肥比例过高均不利于水稻的产量提升，当前后期施肥比例为3：2时，可达到比较适中的比例，既有利于前期的分蘖发生和生物量积累，在后期也可以保障比较好的灌浆程度。对于穗重型品种来说，前期的分蘖肥更有利于其高产，而穗数型品种则是后期的肥料比较很重要。但对于产量构成因素，不同类型水稻品种对不同N肥施用方法反应不同，穗数型品种松粳6号的每株穗数受N肥影响大，而穗重型品种松粳9号的千粒重受N肥影响较大。分蘖相关基因mRNA表达量在分蘖过程中基本呈单峰曲线变化趋势，OsD3和OsD27基因不同施肥方法会使各处理达到峰值表达日期不同。抑制独脚金内酯合成的OsTB1基因的表达量在6月20至6月25日之间会突然地大幅提升，而此时也正好是有效分蘖转为无效分蘖的时段。前期不同的施肥量会对部分分蘖基因的表达量产生影响，高施肥量会提高水稻中促进分蘖的OsD3基因在各个时期的表达量，切会是OsD27基因表达量提前达到峰值。根系的形态和活力表现为，适当减少前期氮肥施用量，并增加后期的氮肥施用量会使水稻下层根系更为发达，拥有更好的根系分布状态。不同施肥处理对总伤流液和平均单茎伤流液量的影响略有不同，水稻产量与总伤流液量有关，且总伤流液与水稻的穗粒数和结实率呈显著正相关关系。水稻生育前期的施肥量对第一节间茎秆长度有影响，而生育后期施肥会显著影响水稻第二节间茎秆的抗折力和长度。各施肥处理对水稻第一节间茎秆直径产生显著影响，但并未对第二节间直径产生显著影响。本试验设置的四种施肥方法对水稻第一、二节间茎秆抗折力均产生了显著影响，水稻茎秆抗折力受后期N肥施用量影响，但同时也受前期N肥施用量影响，前期N肥施用量过大会大幅降低水稻茎秆抗折力。在水稻生育后期施用大量N肥会使水稻茎秆中含N量大幅提升。前后期N肥比例在3:2时水稻的产量构成因素和抗倒特性等优于其他处理表现。关键词水稻；氮素营养；分蘖基因；表达特性；根系；抗倒性II AbstractEffectoftheNitrogenNutritiononCharacteristicsofRiceTilleringGeneandRootandLodgingResistanceAbstractInrecentdecades,inordertoincreasericeproduction,moreandmorepeopletoincreasefertilizerinputs,especiallynitrogenfertilizer.Nitrogenfertilizerinriceproductioncontinuestoincrease,hascausedseriousenvironmentalpollutionandthewasteofresources.Itisthatweattheexpenseofenergyconsumptionandpollutionoftheenvironmenttoincreasethenitrogenfertilizerinputforincreasethericeproduction.Theresultsnotonlyimprovethecostofriceproduction,butalsoleadtoseriouswaterpollutiondamagetotheecologicalbalance,hinderingsustainablericeproduction.Irrationalmethodofnitrogenfertilizerexacerbatedthewasteofnitrogenfertilizerandcontaminatedofsoilandwater.Tothisend,mytestchosentothetypeofmultiplespikeSongjing6whichisplantedincoldareasandlate-yieldingvarieties,anotheristypeofheavypaniclesuperriceSongjing9whichislatematurity.,Icomparativeanalysisofriceyieldcomponents,tilleringgeneexpressioncharacteristics,dynamicsofricerootmorphologyandvigor,stalklodgingresistancetraitsinunifiedamountofnitrogenbutdifferentfertilizationconditionsmethod.Mytestaimedatclarifyingtherelationshipbetweennitrogenfertilizerapplicationmethodsandmanytraitsabove,fortheestablishmentofreducednitrogenfertilizerinefficientandhighyieldofriceincold,andpurposetoprovideatheoreticalbasisforfriendlyenvironmentallycultivationtechniques.Theresultsshowthat:Thehighrationitrogeninearlyorlateispropitioustoimprovetheyieldofrice.Theearlytolateis3:2isthebestproportion,nomaterfortheconductionofthetilleringandbiomassaccumulationorahighdegreeoffillingtothepanicle.Thereismoretillergingfertilizerisgoodtothericeofheavypanicletype.Thereismorenitrogenfertilizerinlateisgoodtothericeofpancilenumbertype.Butthereisdifferentreactionaboutthedifferentricevarietiesanddifferentfertilizermethodsontheyieldcomponent.theSongjing6havemoreaffectedonspikenumberofperplant,andSongjing9havemoreaffectedon1000grainweightaboutthenitrogenfertilizer.Thetwovarietiesofcommonaffectedonnitrogenfertilizeristhespikenumberofperplant.ThemRNAexpressionofrelatedgenesinthetilleringprocesstillersubstantiallysinglepeakcurvetrends.OsTB1isagenewhichispromotingsyntheticthestrigolactone.ThatgeneexpresshighestinJune20than25th,andthisalsohappensintheeffectivetilleringtotheinvalidtilleringperiod.Semiquantitativefertilizationbetweendifferentresultsshowthatdifferentfertilizationimpactofdifferentpartoftilleringgeneexpression.HighfertilizerwillimprovetheexpressionofthegeneOsD3whichispromotetillering.III 东北农业大学农学硕士学位论文Appropriatetoreducethenitrogenfertilizerinearlyandincreasethefertilizerinlatewillmakericerootdevelopedandmakeithasmorelowroot.Itmeansthericerootsystemdistributionstateisbetter.Differnegfertilizationtreatmentshasdifferentbleedingsapanddifferentaveragesinglestembleedingsap.Riceyieldisbasedonthetotalbleedingsap.Thereissignificantpositivecorrelationbetweenthebleedingsapandgrainnumberperspike,seedsettingrate.Thefirstinternodestemlengthisaffectedbythenitrogenfertilizationintheearlygrowthstageofrice,andthesecondinternodestemlengthisaffectedbythenitrogenfertilizationinthelateofgrowthstage.Allfertilizationtteatmentshadsignificantaffectonthefirstinternodestemdiameter,butthereisnoaffectedonthesecondinternode.Thereweresignificanteffectbetweenfourkindsofgertilizationmethodsandthericeinternodalstembendingforce.Ricestembendingstressiseffectedbynitrogenfertilizer.Itwillpromotethenitrogencontaininginricestemifweusehugeofnitrogenfertilizater.Theyieldcomponentsofriceandotherlodgingpropertiessuperiortootherprocessingperformancewhenthenitrogenfetilizerratioofbeforeandlateis3:2.Keywords:Rice；Nitrogennutrition；Tilleringgene；Expressioncharacteristics；Root；LodgingresistanceCandidate:ZhengGuanlongSpeciality:CropGeneticsandBreedingSupervisor:Professor.JinZhengxunIV 引言1引言1.1水稻分蘖研究动态和趋势分蘖是水稻重要的特性之一，直接影响水稻的穗数，从而影响产量。Ishikawa等人的研究认为水稻分蘖的发生受环境因素和激素两种因素控制[1]。无效分蘖对群体的影响也较大，由于其在形成消耗的养分，与正常分蘖产生竞争，所以控制分蘖发生的时期也非常重要。分蘖形成于分蘖芽，分蘖芽形成于叶腋中的分蘖原基，由蘖原基分化出蘖鞘原基，进一步分化出叶原基，当出现第二叶原基时，分蘖芽便形成了，分蘖芽继续分化并发育，在母叶鞘内分化伸长，最后抽出叶鞘成为分蘖[3]。分蘖的构造与主茎秆的结构相同，当分蘖的叶片少于3片时，分蘖的营养来自于水稻主茎的供养，之后便进入自养阶段[4]。分蘖的生成跟主茎叶的抽出时间和数量有一定的规律，每一级的分蘖都比其主茎少3个叶位，且每个分蘖抽出之后还可萌发新的分蘖[5]。1.1.1环境对分蘖的调控水稻分蘖的发生会受一些列环境因素影响，包括光、温、水、肥。分蘖发生的最适温度为30-32℃，低于15℃或高于38℃会导致分蘖的发生停止[8]。当气温达到相对适宜的气温时，稻田湿度对分蘖有十分大的影响。干旱会明显影响分蘖长势，当田间干旱的时候分蘖会出现茎秆过细，高矮不齐，叶片发育不良，叶片枯黄，甚至出现分蘖死亡等明显的发育不良症状，干旱程度越严重症状越明显。土地干旱多会导致无效分蘖过多发生，且成穗率会大幅降低，但如果土地刚表现为脱水而并未开裂时，对分蘖发生的影响不大[6]。水稻分蘖同时也受田间灌水深度影响，田间灌水较浅时有利于水稻分蘖的发生，且灌水浅有利于提升水温。光照强度与分蘖发生成正相关，即光照越强越有利于分蘖的发生，所以浅层灌溉会使水稻分蘖节接受到更多的阳光和更充足的空气，使分蘖处于更有利的发生环境中[7-8]。水稻分蘖的发生于也显著受到受N、P、K等营养元素的调控，但很多研究都表明N素为水稻分蘖期需求量最大的元素，N素有主要调控分蘖的发生，其含量过低会引起分蘖停止等现象。氮素对水稻分蘖生长的影响来自于两个方面，一方面是，通过调节水稻体内的碳氮代谢，另一方面则是调控水稻内源激素的合成来影响分蘖，其中受N肥影响最大的就是细胞分裂素[9]。在以往的实际生产中，基肥和穗肥是最被重视的，所以大量的肥料在水稻的生育前期被施用，但过量的肥料会随着水而流失，不仅浪费而且还造成了污染，而且过量的肥料造成植株贪青迟熟，无效分蘖增加，都不利于水稻产量及品质的提高，且N肥的利用率十分低下[10-12]。而对于如何优化施肥方法，国内有很多学者做了大量的研究[13-14]。其中很多人认为，水稻抽穗期为需要肥料最多的时期，所以增加穗肥的比例，保证水稻后期生长所需的肥料，对增产有着明显的效果。且控制前期施肥量，即节约了肥料，又使水稻在前期能形成良好的群体。1 东北农业大学农学硕士学位论文1.1.2激素对分蘖的调控影响水稻分蘖的激素有很多，生长素（axin，IAA）、细胞分裂素（cytokinin，CTK）、脱落酸（abscisicacid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA）和独脚金内酯（strigolactone，SL）。生长素（IAA）是对水稻分蘖影响最大的内源激素。水稻分蘖的成穗率与水稻后期的功能叶中的IAA含量呈正相关，叶鞘、茎秆和分蘖芽中IAA含量越高，有利分蘖的发生[15]。IAA的作用是抑制侧芽生长，并其在植物顶端合成，通过极性运输向下运送至茎叶基部，抑制侧芽生长。如果能有效去除IAA所产生的顶端优势就可以去除其对侧芽生长的抑制作用[12]。研究表明IAA不是直接进入侧芽而起作用，而是通过在木质部和厚壁组织的运输中起到其间接作用[16]。细胞分裂素（CTK）对侧芽发育起重要的调节作用，通常CTK被认为是第二信使，与IAA一起调控侧芽生长发育。CTK在水稻根系中合成，随后极性运输至分蘖芽，打破分蘖芽的休眠，其浓度受IAA的调控[15-17]。有研究表明CTK破坏了IAA的顶端优势，促进了分蘖芽的生长，但CTK在植株顶端会增加顶端优势[19]。独脚金内酯是近些年被发现的一种类胡萝卜素衍生物，其最早被发现可以打破寄生植物种子休眠，并被广泛的在很多植物中发现，其中包括拟南芥、水稻、豌豆、矮牵牛等。独脚金内酯是在根系中合成的一类倍半萜烯化合物，其中一部分被极性向上运输至植物地上部分，影响植物株型，参与调解侧枝生长；另一部分被释放到根系周围的土壤中，影响丛枝菌根(arbuscularmycorrhizal，AM)真菌的生长[21-27]。独脚金内酯最重要得生物功能就是对植物侧枝生长的影响。独脚金内酯可以抑制植物的侧枝和侧芽的生长，所以在水稻中后期生长如果自身合成或人工喷施的话可以限制水稻无效分蘖的生长，可以优化群体，建立良好的株型。独角金内酯还与其它植物内源激素产生交互作用，共同控制植物株型，也有研究表明独脚金内酯会间接影响生长素的运输与合成[20]。1.1.3基因对水稻分蘖的调控水稻的分蘖是由多基因共同控制的数量性状，且极易受环境因素影响[28]。目前世界上已定位177个有关分蘖的QTL位点，其分布包括了12条染色体，但研究结果也有很大的差异，这其中也包括微效基因和一些在分蘖开始和结束才启动的基因[29]。近年来已有很多基因被做了大量研究如IPA1、MOC1、RCN等。本文则是以参与独脚金内酯合成的几个基因为研究基因。独角金内酯在水稻中被发现与D3、D10、D14、D17、D27、D53、OsTB1等7个基因有关。D3突变体由于外显子1编码第154个氨基酸位点插入了1个448bp的转座子，从而提前形成终止密码子，其突变体表现为茎秆矮化，分蘖增多。D27突变体基因由于第4外显子发生4bp的缺失，从而提前形成终止密码子，其突变体植株表现为茎秆高矮化，分蘖数显著增多。水稻中的OsTB1与玉米种的TB1基因同源，其过量表达的时，水稻植株会呈现分蘖显著减少，并且幼苗粗壮，而OsTB1功能丧失的fc1突变体则表现为分蘖数显著增加[24-27]。2 引言1.2水稻根系研究概况根系是植物最重要的器官，其生长发育是受环境和基因双重调控的。植株所需的绝大多数水分，养分都来自于根系的吸收，根系还合成大量且多种类的激素来调节植株的生长[33]，除此之外根系还与物质的产生、同化和运输分配等有着重大的影响，所以根系的活力与形态就显得十分重要[31]。也有研究表明根系的发育与叶片角度等株型相关[35]。根系的衰老会对水稻植株的生长与水稻籽粒灌浆程度等产生明显影响，所以减缓水稻根系的衰老是保证水稻高产稳产的关键[34]。1.2.1根系活力水稻根系的活力是反应水稻根系生理特征的重要指标，其包括根系α-萘胺氧化力、根系对TTC（氯化三苯基四氮唑）还原力、伤流液强度和根系吸收面积等。根系伤流液的量直接反应水稻根系的活力，且获得的数据较为准确。伤流液的产生是由于根压而产生的。根系伤流液一般在齐穗期前后达到最大值，随后会出现明显的下降。不同品种根系活力和维管束有差异，所以不同品种水稻其伤流液的量变化比较明显。而不同施肥处理也会明显影响水稻伤流液的量，在一天当中伤流液的量也是在时刻变化的，所以取样时应选取同一时间段，相同的时间来收集伤流液。研究表明水稻伤流液与水稻叶片的衰老呈显著正相关，而水稻后期灌浆的速度与水稻叶片的光合效率呈显著正相关[34]。水稻伤流液的强度受N肥调控比较明显，研究表明抽穗后施用N肥对水稻伤流液的量的提高效果极为显著，且N肥对伤流液中激素等物质的含量也有显著影响[37]。但在后期施用过量的N肥会降低伤流液的量，且田间灌水过深也会降低水稻伤流液的量[39]。1.2.2根系形态根系形态的发达与健壮是水稻高产稳产的保证，良好的根系形态是物质同化和运输的良好保证。良好的水稻根系形态表现为根系粗壮下扎深、体积大、根重较重、根长较长、侧枝较多。研究表明根系对水稻穗的颖花数有决定性的作用[41]。水稻的下层根系，尤其是10cm图层以下的根系所占的比例越高，有助于提升水稻的千粒重等产量因素，下层根系对产量的影响占总产量的35%[42]。有研究显示高产水稻的根系，在深层土壤中分布较多。朱德锋等人的研究也表明深层根系对大穗型水稻的产量影响十分巨大，这种影响从穗分化时期就已经开始[40]。但也有人认为根冠比过大会过量消耗光合作用的产物，导致其与灌浆的籽粒竞争光合作用产物，从而不利于高产的形成。环境也对水稻的根系有明显影响，适当的控制田间灌水能够促进根系生长，特别是对侧根的形成，并且能够促进根系向深层土壤生长。但干旱则会严重影响根系的生长发育。N对根系的生长与分布有显著影响。N肥可以促进根冠的发育。在N肥水平较低的条件下，水稻根系的下扎能力显著增强，不定根的根长和根重明显增加[43,44]。N肥在生育前期会显著增加根系的重量，在后期可以显著提高根系活力，延缓根系的衰老[46]。但过量和不当的N肥施用会导致水稻的浅层根系比例增多，不利于下层根系的发育[47]。也有研究表明在水稻生育前期3 东北农业大学农学硕士学位论文施肥，会使水稻根系的侧根和根长增加，且越早施肥这种优势越大[48]。1.3产量及产量因素1.3.1N肥与水稻产量水稻是喜氮作物，其对NH+-4和NO3均有较高的吸收能力，N肥也是各元素中对水稻产量影响最大的元素。赵庆雷等人的研究表明，在不施加N肥时，水稻营养生长受抑制效果明显，有效分蘖数、有效穗数和产量明显下降[49]。但施肥量过多时，水稻会表现为营养生长过旺盛，产量及部分产量影响因素有明显下降。殷春渊等人的研究结果表明，随着氮肥施用量的增加水稻产量呈先上升后下降的抛物线趋势。当施氮量为255Kg/hm2时，水稻产量最高[50]。李华等的研究结果表明，施氮水平在270—330Kg/hm2范围内，随着氮肥施用量的增加水稻产量逐渐上升，当施氮在300Kg/hm2水平时，水稻产量最高。但超过这个范围时，水稻产量则不再增加，反而随着施氮量的增加而下降[51]。马国辉等研究结果也表明，施氮水平在一定范围内，随施氮量的水稻产量升高，但当超出这个范围时，产量下降，但其结果显示施氮量在189.5Kg/hm2时，水稻产量最高[52]。对于N肥对水稻产量构成因素的影响，很多研究者得到的结果并不相同。氮肥对水稻产量构成因素的影响包括氮肥对水稻单位面积穗数、每穗粒数、千粒重和结实率等。研究结果显示，施肥处理对产量的影响主要通过水稻单位面积穗数和每穗实粒数的变化而实现，而不同处理对千粒重的影响不明显[52]。陈明前等研究显示，当基蘖肥的施氮量增加时，分蘖数增多，有效穗数增多，但过量施肥会导致有效穗数减少无效穗增多而减产[53]。施氮量与水稻单位面积穗数、产量相关性较大，其次是每穗粒数，并且都呈正相关[55]。张文香等研究结果表明，氮肥与混合千粒重、饱和千粒重、成粒率呈极显著负相关，且与穗粒数、穗长、一次枝梗数量、二次枝梗数量、穗颈长、着粒密度、株高、生物产量呈极显著正相关[54]。随施N量的增加，单位面积穗数先呈先增加后下降的单峰曲线趋势，每穗粒数则一直增加。拔节期、抽穗期干物质积累量会随施氮量的增加而增加，成熟期的施氮量增加到150Kg/hm2时干物质积累最多，后随施氮量增加下降[56]。1.3.2N肥的合理施用我国的N肥消费已成为全球第一，平均消耗量为158KG/hm2，但N肥的利用率却十分低下，只有大约三分之一的N肥被利用[59-60]，剩下的N素只有少部分留在了土壤中，而绝大部分则被水带走形成了污染，还有一部分会分解为NO2等有害化合物，造成更大的污染与危害，每年因此所产生的经济损失也十分巨大。合理施用N肥对水稻增产与稳产十分重要，N肥的合理施用不仅是对氮肥量的控制，也包括对水稻施肥时期的把握。水稻在移栽缓苗后至拔节期对N肥的吸收量最大，此阶段吸收的N素量占整个生育期所总吸收的N量的50%以上，且其吸收的量随氮肥用量的升高而增加[55,56]。而事实也正是绝大多数的N肥在实际生产中，以基肥和穗肥的形式被施用。以不同4 引言施N量来调整前后期施肥的比例也会对水稻产量起到明显影响，当氮肥水平高时，重视前期施肥比例对水稻增产效果明显，当氮肥水平比较低的时候增加生育后期的施肥比例可以提高水稻产量[57]。前氮后移是对水稻增产非常有利的施肥方法，试验证明提高穗粒肥的比例会显著提高成穗率，结实率、千粒重等产量影响因素，同时近年来的研究也显示少蘖而大穗的新型水稻品种才是今后高产水稻株型的方向[58]，所以尽量提高后期施肥的比例十分重要。1.4水稻抗倒伏特性的研究与概况1.4.1水稻倒伏与预防倒伏是影响水稻高产、稳产、优质的重要因素之一。其多发生在水稻灌浆中后期，倒伏发生的时期越早，倒伏程度越高，造成的产量损失也就越大。水稻倒伏后会导致光合作用和灌浆速率下降，且严重影响水稻地上部分与地下部分的物质运输。水稻倒伏不仅严重降低水稻的产量与品质，还会严重降低机械收获率，造成严重的经济损失[61]。水稻的倒伏多发生于抽穗后，茎秆中贮藏的淀粉等干物质逐渐被运送至籽粒，茎秆的充实程度下降，导致茎秆机械强度变弱，且生育后期穗的重量逐渐增大，使茎秆弯折[65]。水稻的倒伏有两种，茎秆倒伏和根倒伏。根倒伏多表现为水稻全身倒伏，多由于水稻根系发育不良而造成[62]。茎秆倒伏则更为普遍，茎秆倒伏多由于水稻的茎秆细、长、机械强度差引起，且多发生在茎秆基部第一和第二节间。很多研究都表明，水稻茎秆基部茎节充实度高、茎壁厚、节间短则抗倒性强[73]。茎秆中的纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质的含量也会严重影响水稻茎秆的机械强度。所以增强水稻抗倒伏能力的方法有降低水稻高度、增强水稻茎秆机械强度两种。1.4.2N素与水稻倒伏关系增施氮肥是水稻增产的主要栽培措施之一，但增施氮肥会明显增加水稻茎秆的长度，并且降低茎直径和壁厚以及茎秆淀粉、纤维素和木质素含量。并且增施N肥会严重影响茎鞘中氮、钾、硅、钙、镁、铁、锌、铜、锰等矿质元素的含量，从而降低水稻茎秆的强度，增加水稻的倒伏指数[3]。研究表明，茎秆基部节间的倒伏指数与施氮量呈极显著的正相关，与节间长度正相关，与茎粗、茎壁厚度、茎鞘的钾、钙、铜及淀粉、纤维素和木质素含量呈负相关。不合理的施氮容易引起倒伏，如果基肥施用过量大或拔节前追肥过多，会促使水稻分蘖大量产生，群体偏大，并使基部节间拉长变细，茎秆发育质量变差，在风雨天气极易发生倒伏[81]。1.4.3其他元素与水稻倒伏的关系前人的研究表明，K、Ca、Si等很多元素均可以提升水稻茎秆的抗折力。钾肥可提高水稻的抗倒伏能力，促进物质运输[63]。K和Si均可以提高水稻茎秆的木质化程度和硅质化程度5 东北农业大学农学硕士学位论文[75,80]。且增施K、Si肥还可以增加水稻茎秆的纤维素含量，并且增加水稻茎秆的直径。因此在生产中增施K、Si肥可以大幅提升水稻的抗倒伏能力。高产的水稻在前期一定有良好的营养生长的积累，这就意味着高产水稻品种的株型一般都偏高，所以提升水稻茎秆强度比改善株型要更有效且更方便，所以适当的增加K与Si肥的使用量十分重要。1.5研究目的与意义近几十年，为了提高水稻的产量，人们越来越多地增加肥料的投入，特别是氮肥的投入。氮肥在水稻生产中的用量不断增加，已造成很大的环境污染和资源浪费。可以说水稻依赖于施用氮素化肥所获得的增产实际上是以消耗能源和污染环境为代价所取得的。结果既提高了水稻生产成本，也导致水土严重污染破坏生态平衡，阻碍水稻生产的可持续发展。不合理的氮肥施用方法更加剧了氮肥的投入量和资源的浪费以及水土污染。分蘖是影响水稻产量的重要因素之一，其直接影响水稻有效穗数和成穗率，分蘖的发生受基因和环境影响巨大。根系为水稻最重要的器官之一，其在水稻地上部分的调控、物质的吸收同化与运输等方面起着决定性的作用。茎秆抗倒伏特性对水稻的高产、稳产影响极大。鉴于上述水稻生产上存在的实际问题，本试验选用寒地穗数型中晚熟高产品种松粳6号号和穗重型晚熟超级稻品种松粳9号号，在统一施氮量不同施肥方式条件下，比较分析水稻产量构成因素、分蘖基因表达特性，水稻根系形态和活力、茎秆抗倒性状等变化动态，旨在明确氮肥施用方法与上述诸多性状变化间的关系，为确立寒地水稻高产高效减氮环保型栽培技术提供理论依据。1.6研究内容本试验选用寒地穗数型中晚熟高产品种松粳6号和穗重型晚熟超级稻品种松粳9号，进行不同品种及处理间产量及产量构成因素比较分析，不同品种及处理对分蘖及生物量的影响，不同类型品种及不同施肥处理的分蘖基因转录表达量比较分析，不同品种及处理间根系形态和根系活力比较分析，不同品种及施肥方法对抗倒性的影响等。6 材料与方法2材料与方法2.1供试材料选用4个寒地粳稻品种松粳3，松粳6号，松粳9号，松粳12，进行分蘖相关基因的转录表达量分析；选用寒地穗数型中晚熟高产品种松粳6号号和穗重型晚熟超级稻品种松粳9号号，进行生长前后不同氮素营养与产量构成因素、分蘖相关基因表达、根系形态和活力、抗倒性等关系研究。2.2试验方法在2013年进行预备试验基础上，2014年在东北农业大学校内进行盆栽试验。用直径30cm，高35cm规格的圆桶种植。4月1日播种，大棚盘育苗，5月15日插秧，每个品种，每个处理插16盆，其中12盆用于取样，另外4盆用于考种。每盆插长势一致的秧苗4穴，每穴插1棵苗，待缓苗后每盆留2穴，正常水管理。施氮量为纯氮135kg/hm2，并以盆的表面积换算得出每盆的施肥量。N：P2O5：K2O比例为1：0.5：1。氮肥为尿素，磷肥为磷酸二铵，钾肥为硫酸钾。施肥方法是全部的磷肥和50%的钾肥以及总氮肥量的50%做为基肥，于插秧前全层施用，剩余的50%钾肥做穗肥施用。剩余的50%氮肥分别做分蘖肥和穗肥施用，具体施肥量列于表2-1。缓苗后施分蘖肥，幼穗分化始期施穗肥。表2-1施肥处理方法Table2-1Fourkindsoffertilizertreatment分蘖肥穗肥处理1总N肥量的10%总N肥量的40%处理2总N肥量的20%总N肥量的30%处理3总N肥量的30%总N肥量的20%处理4总N肥量的40%总N肥量的10%2.3伤流液收集方法伤流液收集日期为6月20日、6月30日、7月10日和抽穗后的15天、25天、35天。每次收集时间均为当日晚20:00至次日早8:00，各处理每品种每次取2个盆，4穴。收集伤流液前先调查分蘖数，然后从茎秆基部距离土壤表面8cm处截断植株，缠脱脂棉并用保鲜膜包裹。次日收集吸附伤流液的脱脂棉及保鲜膜，分别装入已编号的自封袋，并迅速称重。伤流液收集后，从茎秆基部剪取植株剩下的部分，清理干净后用锡箔纸包好，放于液氮中封存20min，冻存于-80℃中冰箱备用。最后用水冲洗掉盆中泥土得到完整的水稻根系，并测量长7 东北农业大学农学硕士学位论文度、重量和体积。同时调查记录供试材料的株高和分蘖数及叶龄[38]。2.4考种收获时各处理按单株收获，自然干燥后进行室内考种，考种项目包括每穴有效穗数、每穗粒数、千粒重、单株粒重、结实率。2.5茎秆抗倒性测定收获前单独截下新鲜水稻茎秆的第1和第2节间，两端担在两块独立的木板上，木板间距离5cm，使茎秆中间悬空，在中间挂一个小铁钩，铁钩下端链接一个小塑料桶，逐渐向塑料桶内加细沙子直至茎秆刚好弯折。测量小桶、沙子和铁钩的总重即为茎秆的抗折力。抗折力通过1kg=1N换算为力的单位牛顿表示[5]。用格尺测量水稻节间长度，用数显游标卡尺测量水稻茎秆的直径。2.6植株茎秆全氮测定方法取第1和第2节间茎秆去叶鞘，在80℃烘至恒重，用粉碎机粉碎至粉末，过80目筛后用浓硫酸和双氧水消煮，用凯氏定氮法测全氮含量[8]。2.7分蘖基因mRNA表达量测定2.7.1试剂Tris饱和酚，DNAMarker2000，反转录试剂盒，dNTPs、DEPC，酚氯仿异戊醇（25:24:1），异丙醇，氯化锂溶液（8mol/L），乙醇。2.7.2序列获取根据基因登陆号从NCBI上搜索并获取促进分蘖的基因OsD3、OsD27以及抑制分蘖的基因OsTB1基因序列，然后通过BLAST确定各序列CDS区的准确性。2.7.3引物设计分别将三种基因的CDS区序列输入PrimerPremier5.0软件中，限定所需的引物长度、产物大小等要求后获得一些列引物，选取大小合适且无措配、发卡结构等引物，委托上海生工生物有限公司合成引物。8 材料与方法表2-2RT-PCR试验所用引物Table2-2RT-PCRprimersusedintheexperiment引物名登陆号称上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）AccessioGeneUp-primer（5’-3’）Down-primer（5’-3’）nNo.nameAK06547OsTB1GCCGGATGCAAGAAATCTCAGCAGTAGTGCCGCGAA8AB08834CAACATCCAGAGGGAGGAGTGAGAATCTCCCAGCTTCCAOsD33GAGATCTGGGCTAAAGAATGAAAAAGAGCTTGGGTCACAATCTCOsD27FJ641055GGAG2.7.4水稻茎秆基部总RNA提取截取冻存于-80℃冰箱中的水稻茎秆基部，剥去叶鞘，剪取茎秆上白色的部分，并采用冷酚法提取总RNA[104]。2.7.5逆转录第一链cDNA合成在进口的0.5mL离心管内混合下列试剂：药品体积（μL）RNA样品11.0Oligo（dT）（250ng/μL）1.0Total12.0轻微混匀后，放在PCR仪65℃变性5min，冰浴5min，在向管内加入下列试剂：药品体积（μL）5×RTBuffer4.0dNTP（10mmol）2.0RNA酶抑制剂1.0逆转录酶1.0Total8.0混匀药品后，再次放入PCR仪，反应过程为：42℃复性30min，85℃延伸5min，然后4℃处理5min，完成后反应产物在-20℃冰箱中保存备用。9 东北农业大学农学硕士学位论文2.7.6筛选最佳退火温度为了达到更好的PCR效果，根据不同引物合成后所生成的参考退火温度，设定不同的梯度退火温度。一般设置在50℃-60℃，用引物进行PCR扩增，以获得最佳的退火温度。2.7.7PCR反应以反转录得到的cDNA为模板，利用预先设计合成的特异半定量引物进行PCR扩增。反应体系为25μL，其中PCR反应条件为94℃，4min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，45s）；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后对扩增普带用QuantityOne软件进行表达峰度的对比分析。PCR反应体系列于表2-3。表2-3PCR反应体系Table2-3PCRreactionsystem药品体积（μL）10×EasyBuffer2.5dNTP（2.5mmol）2.0PrimerF1.0PrimerR1.0cDNA1.0Easytaq酶0.2ddH2O17.3Total25.02.8统计分析方法以处理为单位用dps软件进行统计分析。10 结果与分析3结果与分析3.1不同品种及处理间产量及产量构成因素比较方差分析结果（表3-1和表3-2）表明，各处理间产量及产量构成因素的F值都达到显著或极显著水平，说明本试验各处理间水稻产量及产量构成因素有显著或极显著差异。表3-1.不同处理对松粳6号产量及产量构成因素的影响Table3-1TheinfluencefactorsonSongjing6yieldandyieldofdifferenttreatments粒重/株（g）穗数/株（个）粒数/穗（个）千粒重（g）结实率（%）处理138.06abA15.9bAB98.90abAB25.27bAB90.92abA处理238.96abA16.1bAB99.20abAB25.73abAB91.09abA处理339.91aA17.9aA100.80aA26.07aA91.49aA处理437.46bA15.1bB97.40bB25.06bB89.46bAF值2.96*7.56**7.53**3.83*6.61*平均值38.6016.2599.0925.5390.74变异系数（%）4.659.292.582.451.46由表3-1和表3-2的平均值可知，松粳6号的产量比松粳9号的产量每株高0.96g，高2.55%。每株穗数松粳6号比松粳9号多3.6个，每穗粒数松粳9号比松粳6号多27.2粒，多27.46%，千粒重松粳6号比松粳9号多1.65g，多6.91%，结实率松粳6号比松粳9号高1.5%。从中可以知道，穗重型品种松粳9号的成熟度、灌浆程度都要比松粳6号低，而这也导致了松粳9号的产量比松粳6号低。松粳6号的处理4产量最低，而松粳9号的处理1产量最低，这说明穗数型品种重视后期肥料有助于增产，而穗重型品种重视前期肥料有助于增产。从变异系数中可以看出，松粳6号的每株穗数的变异系数最大，而松粳9号的每株穗数变异系数为第二大，所以，不同的N肥施用方法对不同品种水稻的每株穗数均有显著影响由表3-1可知，穗数型品种松粳6号各处理在产量方面，处理3的产量最高，而处理4的产量最低，二者每株产量相差2.45g，相差6.54%，而处理3到处理1的产量逐渐下降平均每株相差0.9g。由表3-2可知，穗重型品种松粳9号的产量方面，处理3产量最高，处理1的产量最低，处理3的产量比处理4高1.45g，高出3.89%，处理3比处理1的产量高1.88g，高5.11%。从产量构成因素方面来看，松粳6号号的每株穗数、每穗粒数、千粒重、结实率均为处理3最大，而处理4最低。通过变异系数可以看出，松粳6号的每株穗数对不同施肥方法的反应最大，而结实率受施肥影响最小，影响最大的两组处理，处理3比处理4平均每株多2.811 东北农业大学农学硕士学位论文穗，多18.54%，处理3每穗粒数比处理4多3.4粒，千粒重比处理4多1.01g。说明提高穗肥对穗数型品种松粳6号号的影响最为明显。松粳9号的产量构成因素则表现为处理3最高，而处理1最低，每株穗数和每穗粒数处理2多于处理4，但千粒重和结实率处理4高于处理2。从变异系数来看松粳9号的千粒重受施肥方法影响最大，其次是每株穗数，而每穗粒数受施肥方法影响最小。松粳9号处理3与处理1的千粒重相差1.50g，相差6.47%。松粳9号的这种表现说明生育后期施肥量过大不利于水稻的生长发育。两个不同品种水稻对施肥方法有不同的反应也说明了不同品种的水稻应采取不同的施肥方法来提升产量。表3-2.不同处理对松粳9号产量及产量构成因素的影响Table3-2TheinfluencefactorsonSongjing9yieldandyieldofdifferenttreatments穗数/株粒数/穗粒重/株（g）千粒重（g）结实率（%）（个）（个）处理136.82bB12.3aA125.6bA23.19cB87.02bB处理237.77abAB12.7aA126.2abA24.13abAB88.26abAB处理338.70aA13.0aA127.4aA24.69aA89.27aA处理437.25bAB12.6aA125.9abA23.49bcB87.27bBF值4.91**2.54*3.28*9.98**6.61**平均值37.6412.65126.323.8887.96变异系数（%）3.624.780.888.431.463.2不同品种及处理对分蘖及生物量的影响由表3-3可知，松粳6号和松粳9号相比，各处理分蘖各时期变化比较平均。其生物量变化差异极显著，两个品种在6月20日至6月30日之间生物量有显著变化，6月20日至6月30日之间松粳6号的生物量平均增长为780，而松粳9号的生物量增长仅为485，差异显著。这期间的生物量突然显著增加，由于分蘖在这个时期大量发生。所以在这个时期分蘖越多，越有利于水稻生物量的积累。松粳6号处理3的分蘖在6月30日以后为各处理中最多的，而处理1是分蘖最少的，其在各个时期的分蘖数均比分蘖数最少的处理1多平均2个分蘖。处理3与处理4在6月30日分蘖数就已达到最多，而处理1与处理2在抽穗后分蘖数仍然有小幅度增加。说明前期增加施肥量会对水稻分蘖数有显著影响，但分蘖肥的量过多不利于水稻分蘖的形成。生物量方面，松粳6号在6月20日和6月30日之间有一个很大的提升，处理4的生物量在各个时期均为最大，而其与处理3间无差异，但与处理1和处理2有较大差异。松粳9号各处理也同样表现为处理3的分蘖最多，处理1的分蘖数最少，且差异显著，从6月20日起到7月10日期间，处理3的分蘖比处理1的分蘖多1.5-2.2个，多21.36-53.57%。从发育方面来看，松粳9号分蘖数在6月30日与7月10日之间仍有小幅度增加，说明其生育期更晚。从生物量方面来看，处理3生物量在各个时期最大，处理4其次，处理1最少。12 结果与分析表3-3松粳6号及松粳9号号的株高分蘖变化Table3-3ThechangeofheightandtilleringaboutSongjing6andSongjing9分蘖数（个）生物量品种处理6月20日6月30日7月10日6月20日6月30日7月10日处理14.6cB13.5cB15.3bA200.1bcC816.75cC1078.65cC处理25.0bcAB14.0bcB16.4abA222.5bB911.4bB1213.6bB松粳6号处理35.9abA16.8aA17.9aA264.91aA1140.72aA1349.66aA处理46.0aA15.0bAB17.1abA276.6aA1056aA1356.03aA平均值6.015.017.127610561356.处理12.8bB8.9bB10.3bB129.64dD539.34dD705.55dD处理23.3abAB9.5abAB10.8bAB158.4bcC602.3cC766.8松粳9号处理34.3aA11.0aA12.5aA208.55aA767.8aA937.5aA处理44.0aAB10.6aAB11.3abAB184bB727.16bB836.2bB平均值3.610.011.21746598123.3不同类型品种及不同施肥处理影响分蘖基因转录表达比较3.3.1RNA完整性及定量检测本试验采用冷饱和酚提取不同时期水稻茎秆基部的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳法对提取出的RNA完整性进行检验，结果列于图3-1。图3-1水稻茎秆基部RNAFigure3-1RicestembaseRNA由图3-4可知，从水稻茎秆基部提取的RNA有清晰地两条条带，分别是28S与18S，两条条带的亮度比接近2：1，说明试验中提取的总RNA完整性较好。总RNA用0.1%DEPC水稀释20倍后测定OD260和OD280，计算OD260/OD280比值得知，供试材料总RNA纯度在1.93-2.07之间，说明RNA质量较好。经计算，OD260值范围在0.69-0.80之间，达到了实验的要求浓度，可以进行后续操作。13 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.2基因RT-PCR引物验证本试验用Primerpremier5.0设计三个调控分蘖基因OsD3、OsD27以及OsTB1引物扩增得到的预期目的片段大小依次为343bp、725bp、449bp。对以上三种基因RT-PCR产物进行检验，其电泳测验的结果列于图3-1。由图3-2可知，PCR的产物条带单一且清晰，大小与预期目标片段大小一致，说明引物设计良好，可以用于后续的RT-PCR实验。图3-2三种基因RT-PCR引物大小检验Figure3-2TheinspectionofthreegeneRT-PCRprimersize3.3.3水稻生长过程中分蘖基因mRNA表达量变化动态图3-3不同类型水稻不同时期分蘖基因的mRNA表达量变化Figure3-3ThechangeoftheamountofdifferenttypesofricetilleringexpressionindifferentperiodsofmRNAgene由图3-3可见OsD3、OsD27及OsTB1三种基因分别在不同时期均有清晰的PCR反应条带，可以对各基因进行基因转录表达量的分析。由表3-4可知，四个不同类型的水稻品种在生长过程中OsD3基因的转录表达量变化基本一致，都呈现随着水稻的生长转录表达量逐渐增高，达到峰值后又逐渐递减的单峰曲线变化。但达到峰值的时间品种间有差异，松粳3号和松粳6号是6月30日、松粳9号是6月20日、松粳12号是6月25日分别达到峰值，说明OsD3基因表达有时间性。就该基因表达量大小而言，松粳3号的表达量在各个时期普遍低于其他品种，松粳9号的表达量普遍高于14 结果与分析其他品种。表3-4不同品种水稻不同时期OsD3基因的表达量变化Table3-4ChangesintheexpressionofdifferentricevarietiesindifferentperiodsofOsD3gene品种6月15日6月20日6月25日6月30日7月8日松粳3号0.6720.7500.9681.1251.000松粳6号1.0141.0581.2381.2911.195松粳9号1.4251.6601.3871.2910.919松粳12号1.1631.4131.4271.0841.035表3-5可知，4个不同类型水稻品种的OsD27基因表达量除松粳6号外均呈现双峰曲线，在6月15日是表达量较高，随后在6月20日是下降，但在6月25日再次上升。松粳6号的表达量峰值在6月25日出现，在7月8日下降不明显，为各处理中表达量最高的品种。前4次取样各时期的表达量最高的品种是松粳12号。表3-5不同品种水稻不同时期OsD27基因的表达量变化Table3-5ChangesintheexpressionofdifferentricevarietiesindifferentperiodsofOsD27gene品种6月15日6月20日6月25日6月30日7月8日松粳3号0.7990.8331.3210.9861.000松粳6号1.3411.8471.6031.3661.331松粳9号1.4311.5161.8291.9230.934松粳12号2.1642.4082.2612.5511.108由表3-6可知，抑制分蘖的基因OsTB1在松粳3、松粳6号和松粳9号在6月20日是有一个大幅上升的峰值表达其上升幅度达到38.90%-49.71%，松粳12的峰值则在6月25日且持续至6月30日。而这一时期刚好在无效分蘖的初期。表3-6不同品种水稻不同时期OsTB1基因的表达量变化Table3-6ChangesintheexpressionofdifferentricevarietiesindifferentperiodsofOsTB1gene品种6月15日6月20日6月25日6月30日7月8日松粳3号0.9040.7821.2801.0421.000松粳6号1.2062.3981.5881.1611.277松粳9号1.5142.4182.2011.2910.864松粳12号1.2321.3142.3792.2291.45815 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.4不同施肥处理对分蘖基因mRNA表达量的影响图3-4不同施肥方法对分蘖基因表达量影响Figure3-4DifferentmethodsoffertilizationeffectonTilleringgeneexpression表3-8松粳6号及松粳9号不同时期不同施肥处理OsD3基因mRNA相对表达量比较Table3-8ThecomparisonofOsD3genemRNArelativeexpressionquantityaboutSongjing6andSongjing9indifferentperiodsofdifferentfertilization品种处理6月20日6月30日7月10日处理12.1071.8361.000处理21.7341.5100.816松粳6号处理32.2652.0411.852处理42.0411.9181.969处理11.5251.3061.000处理21.4511.2460.718松粳9号处理31.4151.7881.151处理41.5621.8341.318由表3-8可知，从6月20日至7月10日OsD3在松粳6号中表达量逐渐降低，且处理3，与处理4表达量高于处理1与处理2。OsD3在松粳9号中的表达在6月30日与松粳6号略有不同，在6月30日松粳9号的处理3与处理4依旧处于上升的状态，随后下降。16 结果与分析表3-9松粳6号及松粳9号不同时期不同施肥处理OsD27基因mRNA相对表达量比较Table3-9ThecomparisonofOsD27genemRNArelativeexpressionquantityaboutSongjing6andSongjing9indifferentperiodsofdifferentfertilization品种处理6月20日6月30日7月10日处理10.8410.7901.000处理21.1841.2380.994松粳6号处理31.0790.6970.973处理40.6040.9640.914处理10.4710.3441.000处理20.4950.810.898松粳9号处理30.9320.8710.495处理40.7290.4790.448由表3-9可知OsD27在松粳6号与松粳9号各处理表达量中其处理2和处理3的表达量要高于处理1和处理4的表达量，说明前期肥料的过多和过少都不利于OsD27的表达。而肥料的多少可以影响OsD27的表达时间，可以明显看出松粳9号各施肥处理的峰值表达量出现日期不同，处理3和处理4最先到达表达峰值，而处理1和处理2较晚。两供试品种的处理1在6月20日至7月10日该基因的表达量一直在上升，而处理3和处理4则基本呈现下降趋势。表3-10松粳6号及松粳9号不同时期不同施肥处理OsTB1基因mRNA相对表达量比较Table3-10ThecomparisonofOsTB1genemRNArelativeexpressionquantityaboutSongjing6andSongjing9indifferentperiodsofdifferentfertilization品种处理6月20日6月30日7月10日处理11.0791.0951.000处理20.6510.7740.937松粳6号处理30.7491.1350.904处理40.9960.7601.060处理10.9851.0431.000处理20.8970.8041.183松粳9号处理30.9101.1341.187处理40.8740.7941.137由表3-10可知OsTB1在松粳6号与松粳9号各处理的表达量基本呈现从6月20日至7月10日逐渐增加，其中松粳6号和松粳9号的处理1的OsTB1的表达量在6月20日与6月30日表达量高于其他处理，而其分蘖也是最少的。17 东北农业大学农学硕士学位论文3.4不同品种及处理间根系形态的比较3.4.1品种及处理间根系体积与长度比较由表3-11和3-12中可知，松粳6号在7月10日之前根系体积大于松粳9号的根系体积，而在抽穗后期松粳6号的根系则小于松粳9号，说明穗重型品种松粳9号的根系相比较穗数型品种松粳6号发育较慢，但在生育后期更大。根长方面在6月30日之前松粳6号的根系比松粳9号的长，但在7月10日以后松粳9号的根系更长，且在抽穗25天之后差异更为明显。由表3-11可见，松粳6号的根系体积方面在7月10日之前，各处理根系体积呈现从处理1到处理4逐渐增加的趋势，且差异显著，但在抽穗后15天处理4的根系体积为各处理中最小的，处理3为各处理中最大。在抽穗25天以后，呈现处理2＞处理1＞处理3＞处理4的趋势。根长方面7月10日之前各处理呈现从处理1到处理4逐渐增加的趋势，但6月30日和7月10日各处理根长无明显差异。在抽穗后松粳6号各处理的根长则呈现从处理1到处理4逐渐降低的趋势，这说明在水稻生育后期给予肥料的量对根系生长影响较为明显。表3-11松粳6号根系体积与长度的变化Table3-11ChangesofrootvolumeandlengthonSongjing6处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理113bA23bA23bB45abAB56aA58aAB处理215abA26abA28aA43bAB57aA60aA体积（ml）处理316abA26abA30aA47aA52aAB52abAB处理417aA29aA32aA42bB47bB45bB平均值15.326.028.344.355.053.8处理129.8bA36.9aA38.8aA49.0aA48.0aA48.1aA处理231.2abA36.5aA37.5aA45.0aAB45.3abA45.5abA长（cm）处理332.0abA36.9aA40.5aA44.3aAB44.8abA44.9bA处理433.2aA38.3aA40.5aA39.1bB44.3bA44.4bA平均值31.637.239.344.445.645.7由表3-12可知，松粳9号的根系体积各个处理在各个时期内均达到显著差异。处理4在6月20日是根系体积为最大，其与体积最小的处理2相差4ml，相差25.00%。在6月30日处理3的根系体积最大，7月10日处理2的体积最大，处理1和处理4为最小且差异极显著。抽穗后则呈现处理2＞处理3＞处理1＞处理4，说明前期肥料施用过多并不利于根系的发育，适量减少前期肥料而增加后期肥料可以是水稻根系有更好的发育。根长方面处理3在6月3018 结果与分析日之前为各处理中最长，处理1的根长为最短，其二者相差3.3cm，相差12.22%。从7月10日至抽穗后15天根长呈现处理2为最高，但抽穗后15天各处理间差异不显著。抽穗后25天和抽穗后35天各处理则呈现从处理1至处理4逐渐降低的趋势。表3-12松粳9号根系体积与长度的变化Table3-12ChangesofrootvolumeandlengthonSongjing9处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理111bcB16bB27bB67abAB79abA82bAB处理210cB16bB32aA73aA83aA86aA体积（ml）处理313abAB21aA29bAB70aAB80abA83abAB处理414aA20aA28bAB61bB76bA80bB平均值12.018.329.067.879.582.8处理127.0bA36.1bB41.6bB49.8aA52.8aA54.1aA处理227.6abA38.3bAB48.2aA49.9aA51aA52.1abA长（cm）处理330.3aA40.9aA46aAB49.2aA50.3aA51.8abA处理429.9aA36.6bB45.0abAB49.0aA50aA50.5bA平均值28.738.045.249.551.052.13.4.2品种及处理间根系重量比较由表3-13可见，松粳6号根系0-10cm部分，在6月20日至7月10日的三次取样中呈现从处理1到处理4逐渐升高的趋势，处理4的干重显著大于其他处理。但在抽穗后处理4的0-10cm根系重量却为最轻，在抽穗后15天处理3的根系干重最重，而在抽穗后25天和抽穗后35天处理2为最重，且处理1与处理2的根系干重均较后两者差异明显。说明后期施用的穗肥对浅层根系影响十分巨大。在10-20cm根系在6月20日是呈现处理3最低。6月30日与7月10日的两次取样，各处理呈现从处理1值处理4逐渐降低的趋势。抽穗后15天处理2最大，而最后一次取样的趋势则是处理1至处理4的逐渐下降的趋势。20-30cm根系中个时期变化较为复杂，6月30日为从处理1到处理4逐渐下降的趋势，7月10日和抽穗后十五天均表现为处理1和处理3干重较大。30-40cm的根系在抽穗后15天和25天时处理1的重量最大，但在之后的取样中个处理呈现逐渐下降的趋势，且差异有所减小。19 东北农业大学农学硕士学位论文表3-13不同氮施肥方法对松粳6号不同深度根系干重的影响Table3-13EffectsofdifferentnitrogenfertilizationmethodstodifferentdepthrootdryweightonSongjing6（g）处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理10.610cC2.075cC2.845bB5.910abA8.078aA10.365aA处理20.623cC2.218cC2.895bB6.315abA8.170aA10.618aA0-10cm处理30.853bB2.608bB3.025abAB6.735aA7.928aA7.605bB处理41.048aA3.033aA3.200aA5.293bA4.258bB6.265bB处理10.148abA0.533aA0.545aA1.007aA1.955bB2.408aA处理20.143abA0.348bB0.503bB1.543aA2.348aA1.975bAB10-20cm处理30.133bA0.340bB0.470cC1.075aA2.255aA1.938bcAB处理40.163aA0.235cC0.415dD1.543aA1.213cC1.575cB处理10.200aA0.133bAB0.563aA0.523cBC0.633bAB处理20.133bB0.108bB0.388bBC0.678aA0.623bBC20-30cm处理30.108bcB0.178aA0.428bB0.588bB0.673aA处理40.098cB0.123bAB0.338cC0.465dC0.585cC处理10.120aAB0.113bB0.190aA处理20.125aA0.185aA0.148abA30-40cm处理30.085bB0.113bB0.123abA处理40.128aA0.138bB0.113bA由表3-14可知，松粳9号0-10cm的根系干重在6月20日和6月30日为处理2为各处理中最低的处理，处理4干重最重，但处理间无显著差异，而在7月10日一直到生育后期各处理均表现为处理3最重，处理1最轻，抽穗后期均为处理2的根系干重最重。10-20cm根系在6次取样中均表现为处理2的质量最大，但在前三次取样中处理1的质量最轻，后三次的取样中处理4最轻，这说明控制前期N肥施用量有助于水稻深层根系发育。30-40cm根系处理4在各个时期均为重量最低的处理，在7月10日之后处理2为各处理中根系干重质量最大的处理，处理4最轻的，且在抽穗25天至抽穗后35天质量有明显的下降。40-50cm的根系各个处理在4次取样中均表现为处理2根系干重最重，处理1和处理3的根系干重质量相近，说明通过施用肥料量和时间的控制可以调控水稻根系的形态，且效果较为明显。20 结果与分析表3-14不同氮施肥方法对松粳9号不同深度根系干重（g）的影响Table3-14EffectsofdifferentnitrogenfertilizationmethodstodifferentdepthrootdryweightonSongjing9处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理10.508aA0.938aA1.007bB6.428bA9.175abAB10.065aA处理20.505aA0.930aA1.225aAB7.135aA9.570aA10.338aA0-10cm处理30.578aA0.960aA1.318aA6.625abA9.083bAB10.173aA处理40.593aA0.973aA1.178abAB5.133cB8.710bB9.783aA处理10.235abAB0.348aA0.503bB2.663abAB2.563abA3.105aA处理20.268aA0.350aA0.620aA2.813aA2.825aA3.133aA10-20cm处理30.218bcB0.343aA0.595aA2.635abAB2.635abA3.025aA处理40.195cB0.325aA0.535bB2.475bB2.465bA2.915aA处理10.133aA0.300aA0.623aA1.388aA1.318aA处理20.105abA0.335aA0.643aA1.440aA1.350aA20-30cm处理30.103abA0.335aA0.618aA1.238aA1.320aA处理40.098bA0.305aA0.600aA1.203aA1.285aA处理10.063bAB0.123bB0.235abAB0.288abA处理20.095aA0.170aA0.268aA0.303aA30-40cm处理30.078abAB0.123bB0.218bcB0.285abA处理40.055bB0.098bB0.195cB0.260bA3.4.3不同类型品种根系各部分比重的差异由表3-15和3-16对比可知，穗数型品种松粳6号与穗重型品种松粳9号的根系分布状态相比趋势相似，均说明前期施肥会影响浅层根系的发育，而后期的穗肥则会大幅影响根系末端的发育状态，但不同的品种对肥料的反应略有不同。由表3-15可知，松粳6号根系0-10cm根系比重在6月20日至6月30日和抽穗后25及30日呈现处理1至处理4逐渐升高的趋势，且这一部分根系处理3、4始终比处理1、2的比重占的多。但10-20cm以及20-30cm部分的根系比重呈现处理1到处理4逐渐降低的趋势，说明前期处理4前期肥料过多而导致根系大多在浅层分布。在7月10日到抽穗后15天各处理间表现为处理3的数值最大。抽穗25天以后处理4的比例最大，处理2的比例最小。10-20cm根系在6次取样中各处理均表现为从处理1至处理4逐渐降低的的趋势，且差异十分明显，这说明在前期肥料的调控下，低肥料处理的根系在深层土壤分布更多，且后期施肥量的多少对这种趋势影响不显著，根系的分布很可能受前期肥料调控影响巨大。20-30cm根系除7月10日以外也呈现从处理1至处理4逐渐降低的趋势。30-40cm根系在6月30日是呈现从处理1至处理4逐渐降低的趋势，在7月10日时呈现处理3为最大，在抽穗后期则呈21 东北农业大学农学硕士学位论文现处理1值处理4逐渐升高的趋势，这可能是由于穗肥的施用会影响到深层根系的生长，所以穗肥施用量较少的处理深层根系相对较多。表3-15松粳6号各处理根系各部分比重（%）Table3-15TheproportionofrootsineachtreatmentonSongjing6（%）处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理171.61cB61.13cB63.35aA68.04aA65.84bB64.23dD处理272.43bcB63.91bB63.39aA68.96aA65.89bB65.11cC0-10cm处理373.94bAB69.19aA64.43aA69.18bB65.48bB66.31bB处理476.77aA71.79aA63.62aA69.17bB67.40aA67.53aA处理125.66aA28.96aA28.08aA22.90aA24.08aA25.44aA处理224.67aA26.45aAB26.35abA22.99aA23.79abAB24.54aA10-20cm处理324.43aAB21.16bB26.13abA22.71aA24.12aA23.19bB处理422.02bB20.04bB24.31bA22.62aA22.05cC21.14cC处理12.72aA9.46aA7.82bB9.06aA8.21cC8.29bB处理22.65aA9.23aA9.43aAB8.05bB8.31bB8.31bB20-30cm处理31.64bB7.88abAB10.38aA8.11bB8.35bB8.45bB处理41.21cC6.87bB9.50aA8.21bB8.42aA9.18aA处理10.45aA0.75aA1.65cC1.87cC2.04abAB处理20.41aAB0.83aA1.66cC2.01abAB2.05abAB30-40cm处理30.29bBC0.88aA1.89bB2.04abAB2.05abAB处理40.28bC0.76aA1.98aA2.14aA2.15aA由表3-16可知，松粳9号的0-10cm根系在7月10日之前呈现从处理1至处理4逐渐升高的趋势，在抽穗后25至35天处理1和处理4的比重较大，这说明后期穗肥对松粳9号的浅层根系的影响程度远大与其对松粳6号的影响。10-20cm根系中各处理在6月20日成从处理1至处理4逐渐降低的趋势，在7月10日呈现从处理1至处理4逐渐升高的趋势，在抽穗后25至35天又呈现以处理2所占比重虽大，处理4所占比重最小。20-30cm根系在7月10日之前呈现从处理1值处理4逐渐降低的趋势，在抽穗后20-30cm的根系则呈现单峰曲线趋势，在后期处理2的数值较高。30-40cm根系在7月10日之前呈现从处理1值处理4逐渐降低的趋势，但在后期处理3和处理4的根系分布要多与前两组处理，这说明后期穗肥施用过多并不利于深层根系的发育。40-50cm根系在抽穗后15天呈现从处理1值处理4逐渐增加的趋势，在最后两次的去取样则表现为处理2最低。22 结果与分析表3-16松粳9号各处理根系各部分比重（%）Table3-16TheproportionofrootsineachtreatmentonSongjing9抽穗后15抽穗后25抽穗后35处理6月20日6月30日7月10日天天天处理171.69dD55.07cCD53.21cC62.82aA62.51bB62.43bB处理272.65cC55.99cC54.03bB62.65bB61.76aA61.01aA0-10cm处理373.57bB58.37bB54.58bB62.62cC61.38bB61.16cC处理475.83aA59.70aA55.34aA61.9cC63.63bB63.25bB处理126.41aA31.67bB27.46cC27.85cC23.90aA23.69bB处理225.48bB33.49aA28.90abAB27.92abAB24.30bB24.94cC10-20cm处理324.67cC31.76bB29.08abAB27.21aA24.30aA24.47aA处理422.50dD31.33bB29.92aA28.73aA22.46aA22.48bB处理11.90aA11.91aA14.87aA7.47aA10.93bB10.72bB处理21.87aA9.40bB13.13bB7.65bB11.64aA11.13aA20-30cm处理31.76bB8.86cC12.64bcC7.84aA11.20abAB10.88bB处理41.66cC8.09cC11.58dD7.58aA10.70bB10.78bB处理11.35aA4.45aA1.68bB2.38abAB2.83bB处理21.12abAB3.94bB1.60bB2.03abAB2.63bB30-40cm处理31.01abB3.7bB2.15aA2.82aA3.15aA处理40.88cC3.15cC1.56bcBC2.88aA3.14aA处理10.17bB0.29bB0.33aA处理20.18bB0.28bB0.29bB40-50cm处理30.18bB0.30abAB0.34aA处理40.23aA0.33aA0.35aA3.5不同品种及处理间根系活力比较由表3-17可知，松粳6号与松粳9号相比较，松粳6号中有3组处理伤流液峰值出现在抽穗后15天，较为延后，出现这种情况可能为松粳6号对肥料影响较为明显导致。但就伤流液量的比较，抽穗后期松粳6号的伤流液明显低于松粳9号，说明穗重型品种松粳9号在后期根系的活力远高于松粳6号。松粳6号的伤流液变化在6月20日至和6月30日各处理呈现从处理1到处理4伤流液逐渐增多的趋势，但处理4与其他三组处理的伤流液最高峰日期不同，处理4的伤流液高峰更为提前，在7月30日达到最大，而其他处理是在抽穗后15天伤流液的量达到最大。在7月10日之后各处理则呈现处理3最高，在抽穗15天之后处理4的伤流液量为各处理中最少的处理。在生育前期处理4的伤流液为各处理中最多的，但在抽穗后却为各处理中伤流液最少的，说明处理4后期根系衰老的速度要更快。处理3在7月10日之后的各个时期内均保持23 东北农业大学农学硕士学位论文伤流液量最多，但其与其它处理的差异在水稻生育后期则表现为差异越来越小。松粳9号在伤流液趋势与松粳6号各时期内表现相似。各处理在7月30日之前表现为从处理1至处理4伤流液逐渐增多的趋势，松粳9号仅处理1的伤流液峰值出现在抽穗后15天，其余三组处理的伤流液峰值均出现在7月10日。处理4在7月10日之前都为伤流液最多的处理，在7月10日之前各处理均呈现处理1值处理4递增的趋势。但在抽穗后处理4的伤流液则是各处理中最低的，处理3是各处理中最多的，这说明后期施肥量对水稻伤流液影响较为明显，后期施用较多的肥料并不利于保持根系活力。表3-17不同处理松粳6号及松粳9号的伤流液（g）变化Table3-17ThechangesofdifferentprocessingthebleedingsagofSongjing6andSongjing9品种处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理12.24cC3.89aA5.88bA6.39bcB4.03aA3.95abA处理23.24bcBC4.22aA6.05abA6.70abA4.15aA4.18aA松6处理34.24abAB4.47aA6.77aA7.10aA4.64aA4.23aA处理45.24aA4.59aA6.33abA5.31cC3.69abAB3.21bB平均值3.744.296.266.384.133.89处理12.58cC3.84cC6.02cC6.65abA5.26abA5.19aA处理23.33bcBC4.84bcBC7.02bBC6.95aA5.41abA5.42aA松9处理34.33abAB5.84abAB7.77abAB7.65aA5.96aA5.77aA处理45.11aA6.57aA8.52aA6.40bB5.21abA5.02abA平均值3.845.276.946.915.465.35由表3-18可知，松粳6号与松粳9号相比较，单茎伤流液比总伤流液显示的差异更大。松粳6号在抽穗后15天与25天之间单茎伤流液有一个显著的降低，说明松粳6号的根系在此时有一个显著的衰老过程。松粳9号的平均伤流液在后期下降没有松粳6号明显，松粳9号的单茎伤流液在各个时期均比松粳6号多。从松粳6号和松粳9号的单茎伤流液变化上看，肥料对根系活力影响极显著。松粳6号的单茎伤流液变化为，6月20日为各日期中单茎伤流液最多的，但在6月30日则呈现下降趋势，在7月10日有再次上升。在7月10日之前各处理均表现为从处理1到处理4逐渐增加。再生育后期则表现为处理2为单茎伤流液最多的处理，处理1的上伤流液最低。松粳9号的单茎伤流液也有两个峰值出现日期为6月20日和7月10日，与松粳6号的趋势相同。处理4为前期单茎伤流液最多的处理，且量明显高于其他处理。生育期后期则为处理2的单茎伤流液最多，处理1和处理4的量无差异且最低。24 结果与分析表3-18不同处理松粳6号及松粳9号的单茎伤流液（g）变化Table3-18ThechangesofdifferentprocessingtheaveragesinglestembleedingsagofSongjing6andSongjing9品种处理6月20日6月30日7月10日抽穗15天抽穗25天抽穗35天处理10.57cC0.29bB0.50cC0.43aA0.22aA0.20aA处理20.62cC0.40aA0.51cC0.46aA0.30aA0.25aA松粳6号处理31.06abAB0.40aA0.66bB0.46aA0.27aA0.23aA处理41.25aA0.42aA0.73aA0.33aA0.25aA0.21aA平均值0.880.380.600.420.260.22处理10.80cB0.64bB0.86bcB0.43bB0.33abA0.29bcA处理21.42abA1.07bAB1.02bB0.48aA0.42aA0.39aA松粳9号处理31.45abA1.50abAB1.04bB0.45bAB0.40aA0.35abA处理41.70aA2.21aA2.19aA0.42bB0.30abA0.29bcA平均值1.341.361.280.450.360.33由表3-19可见，水稻的总伤流液与产量的相关性高于水稻平均伤流液的相关性，松粳6号的后期平均伤流液与每穗粒数和结实率呈现显著正相关，松粳9号的伤流液与结实率成显著正相关。说明后期水稻根系活力的高低对水稻产量及产量因素有显著影响表3-19水稻生育后期平均伤流液与产量及产量因素的相关性Table3-19Thecorrelationbetweentheaveragesapflowatlategrowthstageofriceandyieldandyieldfactors与每株粒与每株穗与每穗粒与千粒重与结实率重数数总伤流液0.9350.8870.967*0.9230.988*松粳6号平均伤流0.8390.6360.7390.8690.806液总伤流液0.9260.8220.9460.9160.953*松粳9号平均伤流0.6550.5890.5370.7580.741液3.6不同品种及施肥方法对抗倒性的影响由表3-20可知，松粳6号与松粳9号相比较，松粳6号第一节间处理1和处理4为更长，但松粳9号则表现为处理2和处理3更长。松粳6号的第一节间茎秆直径和抗折力数值均比松粳9号低，且差异显著。第二节间长度则是松粳6号比松粳9号长，茎秆直径和抗折力的数值松粳6号低于松粳9号。松粳6号第一节间长度从处理1到处理4长度逐渐增长，最大相差0.91cm，相差23.39%。25 东北农业大学农学硕士学位论文茎秆直径呈现处理3为最粗，而处理4最细，直径相差0.655mm，相差15.24%。各处理抗折力也呈现处理3为抗折力最高，处理4为抗折力最低，而处理3与处理4相差0.107N，相差18.84%。说明后期N肥使用量对水稻茎秆抗折力产生了显著影响，但处理4的差异也说明了茎秆抗折力同样受前期肥料的影响，前期肥料过多不利于水稻茎秆抗折力增强。第二节间长度、茎秆直径和抗折力均表现为处理3的值最大，而处理4的值最小。第二节间长度处理3最长，处理1最短，二者相差1.18cm。茎秆直径和抗折力数值为处理3最高，而处理4最低，二者相差10.34%和27.66%。松粳9号第一节间长度也呈现从处理1值处理4逐渐上升的趋势，处理1和处理3相差0.78cm相差21.49%。茎秆直径呈现处理3为最粗，处理4最细，但无差异。抗折力为处理3最大，处理4最小，二者相差0.052N。节间长度为处理3最长，处理1最短二者相差1.72cm，相差17.38%。茎秆直径无差异。抗折力最大的处理3与最小的处理1相差0.120N，相差26.03%。松粳6号和松粳9号的第一、第二节间变化趋势基本相同，第一节间变化趋势与前期施肥量成正相关，所以说明前期施肥对第一节间长度有较大影响。各N肥处理仅对松粳6号第一节间茎秆直径有影响，对第二节间直径无影响。表3-20松粳9号及松粳6号各处理第一节间及第二节间的抗倒伏性状比较Table3-20ComparisonofthelodgingresistancetraitsofthefirstinternodeandthesecondinternodeaboutSongjing9andSongjing6第一节间第二节间节间长茎秆直节间长度茎秆直品种处理抗折力（N）抗折力（N）（cm）（mm）（cm）（mm）处理13.89aA4.318bA0.602abA11.60abA4.067aA0.377abA处理24.03aA4.550abA0.660aA11.83abA4.084aA0.398abA松粳6号处理34.08aA4.954aA0.675aA12.78aA4.182aA0.480aA处理44.80aA4.299bA0.568bB12.37aA3.79abA0.376bA平均值4.204.5290.62612.154.0310.408处理13.63bA5.188aA0.823abAB9.93aA4.605aA0.461abAB处理24.17abA5.224aA0.841aA10.44abAB4.636aA0.521aA松粳9号处理34.23abA5.290aA0.868aA11.65aA4.670aA0.581aA处理44.41aA5.184aA0.816abAB10.29abAB4.528aA0.464abAB平均值4.115.2220.83710.584.6100.507由表3-21可知，松粳9号的茎秆含氮量在中期和后期的平均值均高于松粳6号，并且松粳9号与松粳6号在中期和后期各处理的趋势也相同，说明不同施肥处理对不同品种水稻茎秆影响基本相同。松粳6号与松粳9号在生育期中期的时候处理3的茎秆含氮量为最高，处理4其次，但松粳6号各处理差异均较大，而松粳9号的处理4处理2和处理1差异较小，且松粳6号月26 结果与分析松粳9号的相同处理间，松粳9号的含氮量更高。其茎秆中的N含量越高说明蛋白质及叶绿素含量越高，即根系在前期的活性越高对后期生殖生长越有利。生育后期各处理间趋势则与生育中期完全相反，两品种处理3均为最低处理4其次。且松粳6号各处理的含氮量均比松粳9号低。在后期处理3的茎秆含氮量最低，说明茎秆中的大部分N元素转移至籽粒中，这有利于提高水稻籽粒的灌浆程度。而后期处理1和处理2的茎秆含氮量较高也与后期施用了较多的N肥有关，而其趋势也与后期施穗肥相同。而茎秆含氮量处理3低于处理4则可能是由于后期施用了比较恰当的N肥而是其后期茎秆中的转运速度大大提升导致的。表3-21植株茎秆全氮含量（%）Table3-21Thetotalnitrogencontentofplantstalks品种处理中期后期处理12.380bB0.983aA处理22.597abAB0.975abA松粳6号处理32.867aA0.703cC处理42.727aA0.904bB平均值2.6430.891处理12.617abA1.029aA处理22.620abA1.010aA松粳9号处理32.967aA0.820cC处理42.663abA0.933bB平均值2.7170.94827 东北农业大学农学硕士学位论文4讨论4.1关于水稻分蘖基因表达特点及氮素响应分蘖是提高水稻产量的重要农艺性状，分蘖数的多少直接影响穗数。分蘖的多少主要受品种和环境因素的控制。苏东行等[82]的研究指出水稻分蘖时期给予其大量N肥可以使分蘖数增多，并且在前期可以有较高的干物质积累。HasegawaH的研究也表明，水稻的生物量积累越多，生物量对产量的作用越大[83]。但氮肥施用量过多会使植株贪青迟熟，并且会抑制分蘖的发生。大量试验证明水稻前期发育会对后期生殖生长起到明显影响，继而影响水稻产量及产量构成因素[8]。但重视水稻后期施氮比例，可以减缓水稻剑叶的衰老，提升光合速率，大幅度减少稻米恶白率，使水稻籽粒品质提升[9]。本研究结果表明，前期N肥的差异在10%就能引起分蘖的明显差异，而此差异在多分蘖的松粳6号中持续到收获，分蘖肥10%和40%的两组处理的分蘖数差异始终为2个。N肥对松粳9号前期影响小于对松粳6号的影响，且有明显差异，分蘖肥10%和40%的两组的分蘖差异为1个。从分蘖基因表达结果中也可已看出，处理3和处理4的OsD3表达量明显高于处理1和处理2，且松粳6号的基因表达量始终高于松粳9号。而抑制分蘖的OsTB1基因在处理1前期的表达量抑制很高，这可能是由于基因的累加作用引起的，这说明分蘖肥施用量的重要性以及N肥可以减弱抑制分蘖基因的表达。说明前期分蘖肥对水稻分蘖影响巨大，尤其是对多分蘖类型的水稻品种影响更大。且处理3在产量、结实率、千粒重等方面均高于其他处理，这可能与其前期分蘖肥比较充足，而后期的穗肥没有过量有关。虽然处理1与处理2后期穗肥施用量较大，但整体产量依旧不如处理3。4.2关于水稻根系生长特点及其与氮素营养关系根系是所有作物最重要的器官，水稻根系发育的好坏会直接影响水稻产量以及各产量构成因素。伤流液的多少反映了根系主动吸收水分的能力，是根系活力水平的体现[85-87]。研究表明前氮后移会使水稻根系在抽穗后20天的根系活力明显高于正常处理的水稻，从而提高水稻的灌浆率、籽粒的饱满度而增加产量。但氮肥用量过高会使水稻根系过量生长，消耗大量的能量，从而降低水稻根系的活力及含糖量[89-90]。刘桃菊等的研究表明，水稻根系形态与产量呈现显著正相关，根系的形态是水稻根系优劣的重要体现，根系形态主要分为根系表面积、体积和根系分部情况[96]。朱德峰等研究表明，水稻深层根系占的比例与产量呈显著正相关，而浅层根系所占比例与产量呈负相关，说明良好的水稻根系形态应该是下层根系多的根系[91]。本研究结果表明，N肥对水稻根系活力影响巨大，前期施大量的N肥会使根系活力在前期有较大提升，使植株在前期积累良好的生物量，而水稻生育后期的穗肥并不是越多越好，过多和过少都会使根系的衰老加快。松粳9号与松粳6号相比较后期对肥料需求有些不同，就松粳9号而言生育后期需要更多的N肥，所以对不同类型品种施肥应根据品种需肥量而做28 讨论调整。根系形态方面本试验的施肥处理也达到了显著差异，并且此差异在松粳6号的根系中表现更为明显，根系的体积与长度等因素在本实验中并未与产量有明显相关性，根系的分部情况才是更为主要的。4.3N素营养对水稻产量及产量构成因素的影响N肥对水稻的每株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重等因素均能起到显著的影响。苏祖芳等认为，水稻的分蘖并不是越多越好，单株穗数过多会导致无效和低效生长多，影响籽粒灌浆等诸多因素[10]。所以在保证正常分蘖数量时的施肥条件下，适量的减少基肥，而增加后期N肥用量可以促进大穗的形成。史鸿儒等人的研究表明重视水稻后期施肥能显著提高实粒数[42]。也有研究表明重视后期N肥的施用会显著提升水稻的千粒重[84]。N肥是直接影响水稻产量的肥料，N肥的施肥量以及施肥的时间都会直接影响水稻的产量。前期增施N肥有利与增加分蘖数，从而影响水稻的成穗率，并且能在前期获得良好的生物量积累。增加后期N肥用量可以改善物质的分配与转运，有利于防止早衰，以提高水稻灌浆速率，增加水稻的千粒重和结实率，从而提高水稻产量[98]。孙国才等人的研究表明前期后期的N肥比在6：4时产量最高，崔月峰等人的研究表明低N肥水平下，重视穗肥有利于提升水稻结实率和千粒重，使产量稳定，并且较低N素施用水平可以有效调节产量构成因素，从而增加N肥的利用率，提升经济效益。本研究结果显示，前期和后期N肥施用量过高均不利于水稻产量和产量因素的提高，重视前后期的施肥比例十分重要。前期施肥量过少或过多都会降低水稻的每株穗数、每穗粒数、千粒重、结实率。而对于穗重型品种松粳9号而言，前期肥料对其的重要性要高于前期肥料对松粳6号的重要性，这也验证了前人的研究，前期的生物量积累有利于大穗的形成。N肥水平在135kg/hm2的纯氮时，N肥前后期不同比例对不同类型水稻品种在产量构成因素上有不同影响，对于松粳6号号，N肥对其分蘖数影响最大，而松粳对于9则是其千粒重受N肥影响最大。增施生育后期N肥显著提升了千粒重与穗粒数。就松粳6号的产量来看增施后期N肥会使其在产量上超过前期大量施肥的处理，说明前N后移对分蘖多的水稻品种增产效果显著。4.4生育前后期N素营养与水稻抗折力的关系水稻倒伏会严重影响水稻的高产与优质，水稻倒伏常发生在水稻的生育后期，发生的位置在水稻的第一和第二节间。水稻第一和第二节间茎秆的长度、直径与充实度都直接影响水稻茎秆的抗折力。研究表明，N肥的施用量与水稻茎秆抗折力呈显著负相关，N肥施用过多会使水稻茎秆节间伸长，机械强度下降，导致水稻茎秆的抗折力下降。茎秆中N含量过高会导致茎秆中物质积累减少，导致茎秆的机械强度下降[63]。但N肥使用量少会减少水稻产量，N肥对抽穗后的大穗型品种的灌浆影响尤为显著。所以如何调控水稻抽穗后期的肥料非常重要。大量研究表明适当增加株高会增加水稻的产量，即增加水稻的生物量积累能增加水稻产量[70-,72]。研究显示株高与穗重呈极显著正相关，而大穗少蘖的株型又是公认的高产水稻株型，29 东北农业大学农学硕士学位论文但过高的株高会导致水稻抗倒伏性下降，因此增强水稻茎秆机械强度是今后的重要研究方向本试验研究结果表明，在水稻生育前后期施用不同比例的N肥，会对第二节间的茎秆物理性状产生显著影响，而处理3的第二节间茎秆长度最长，说明第二节间在抽穗后期受抽穗肥的影响显著。而第一节间是处理4最长，说明第一节间的伸长只受生育前期的N素调控。茎秆抗折力方面N素调控对两供试品种表现均为对第二节间影响较为显著。所以调控N肥的施用量与施用时间可以显著改善水稻第二节间的机械强度。茎秆N含量显示后期N肥施用量过多会使茎秆中N含量显著提升，不利于茎秆抗折力的提升。30 结论5结论（1）通过调控肥料的施用时期和比例可以对水稻产量产生显著影响，适当增加后期施肥比例可以显著提升水稻的产量。（2）穗数型品种提高后期肥料比例有助于产量的提升，穗重型品种提高前期肥料施用比例有助于提高产量。（3）前期肥料调控可以影响水稻分蘖相关基因的表达量，高N肥用量可以提升水稻分蘖基因的表达持续时间。（4）良好的根系分布有利于产量的提高，根系活力对水稻产量的影响最为直接，提高根系活力有助于提高水稻结实率和穗粒数。（5）施肥方法主要影响茎秆的长度与机械强度。第二节间茎秆的抗折力和节间长度受穗肥调控比第一节间显著，后期穗肥过多不利于增强第二节间机械强度，还会显著增加第二节的节间长度。后期茎秆含氮量受前后期肥料共同调控。31 东北农业大学农学硕士学位论文致谢东流逝水，叶落纷纷，荏苒时光匆匆走过。三年时光转眼已变成了片片回忆，留下的是五味陈杂。金老师用三年的时间不仅教会了我很多专业知识，他的严谨的思想和认真的作风也对我产生了深远的影响。本篇论文从选题、设计、正式试验到撰写论文金老师对我费心良多，是您无数的督促与指正才使我顺利的完成学业。在此我向您表示最衷心的感谢，感谢您三年来对我学业上的指导和生活中的帮助。在此也要感谢孙静老师一直以来对我的关照和帮助。同时也要感谢本实验室所有的同学们，徐振华、曲莹、朱丽楠、朱方旭、郭雪冬、孙璐璐、欧凯、李丹、李明月、高玉磊，佟拉嘎等人对我的支持。同时感谢我的室友在三年中给我的帮助。最后要感谢我的父母和家人在我攻读硕士期间一直以来对我的支持和鼓励。希望大家幸福、健康。本论文是科技部“十二五”科技支撑计划项目(编号：2011BAD16B11-02YJ02)和“十二五”农村领域国家科技支撑计划项目（编号：2013BAD20B04-2S）的部分研究内容。32 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