新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产致病菌

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1、学校编码10390分类号081学号201211710006密级硕士学位论文新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产致病菌指导教师：林鹏教授作者姓名：顾宏杰串请学位级别：硕士科专业：生物学研究方向：-生物化学与分子生物学论文提交曰期：2015年04月07日论文答辩日期-2015年06月09日学位授予单位：集美大学学位授予曰期：2015年06月答辩委员会主席：谢潮添教授论文评阅人:学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研宄工作及取得的研宄成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果

2、。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人（签名hi时间：厕保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阋和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。作者（签名）：导师（签名）：^时间：別夂硕士学位论文新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产致病菌NewTime-resolvedFluoroimmunoassayforPathogenicBacteriainAquacul

3、ture学科门类：理学作者姓名：顾宏杰指导教师：林鹏教授专业名称：生物学研究方向：生物化学与分子生物学学位授予单位：集美大学论文答辩日期：2015年06月09日新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产致病菌摘要我国是世界水产养殖大国，养殖规模位居世界前列。但目前的高密度集约化养殖使得病害发生日益频繁，尤以细菌病最为严重，传统的荧光抗体法、酶联免疫分析法均存在背景荧光较高，灵敏度低等缺陷，时间分辨荧光免疫分析法作为一种高灵敏的检测方法已在食品、化学等领域引起重视；课题组首次应用时间分辨荧光免疫分析法检测了产酸克雷伯氏菌，我们在此基础上探索了TRF

4、IA检测致病菌的新方法，主要内容如下：1.建立了双标记TRFIA检测嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12，将致病菌直接包3+3+被微孔板，Eu-IgG、Sm-IgG作为检测抗体对其进行检测，嗜水气单胞菌B18和产6酸克雷伯氏菌B12检测灵敏度均为1.0×10cfu/mL，灵敏度较低存在很大的可拓展空间。2.为了进一步提高检测灵敏度，将抗嗜水气单胞菌B18抗体和抗产酸克雷伯氏菌B12抗体包被微孔板，建立了嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12的双抗夹心双标记3+3+TRFIA法，通过对包被IgG、Eu-IgG及Sm-IgG进行优化产酸

5、克雷伯氏菌B12的检44测限达到1.0×10cfu/mL，嗜水气单胞菌B27的检测限为6.0×10cfu/mL，标准曲线47在1.0×10-1.0×10cfu/mL范围内线性良好，相关系数达99%以上，均优于目前常用的荧光抗体法及ELISA法，且特异性好、重复性好、亦可用于实际样品检测。3.利用生物素标记抗嗜水气单胞菌抗体，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与其发生特异反应后，先后加入反应底物二氟苯水杨酸酯，在酶催化作用下，反应产物能够与3+Tb-EDTA生成时间分辨荧光溶液，以此建立的酶放大时间分辨荧光分析法检测嗜水26气单胞菌B18。标准曲线

6、在1.0×10-1.0×10cfu/mL范围内线性良好，该方法的灵敏2度为1.0×10cfu/mL，优于双抗夹心双标记时间分辨荧光免疫分析法，且特异性好，重复性好，可用于实际样品检测。4.本课题组先期已合成出新型螯合剂DTPA-pAS，但直接与抗体标记，灵敏度较低；本研究在此基础上，通过多聚赖氨酸改进标记比，建立了检测嗜水气单胞菌B18的TRFIA5法，灵敏度为1.0×10cfu/mL。关键词：时间分辨荧光免疫分析；酶放大时间分辨荧光；嗜水气单胞菌；产酸克雷伯氏菌；稀土螯合物INewTime-resolvedFluoroimmunoass

7、ayforPathogenicBacteriainAquacultureAbstractTheaquacultureisadvancedinChina.Itsscaleisamongthehighestintheworld.Theinfectionofpathogenicbacteriathatcausesmassivedeathofaquaticanimalsisapressingproblemforaquaculture.Thecommonlyusedflorescentantibodyandenzyme-linkedimmunoso

8、rbentassaysufferfromhighbackgroundfluorescenceandlowsensitivity.Time-resolvedfluoroimmunoassay(T