高效靶向cck2r重组毒素的筛选、抗肿瘤活性及适用胃癌病例分析

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1、高效靶向CCK2R重组毒素的筛选、抗肿瘤活性及适用胃癌病例分析ScreeningoftherecombinanttoxintargetedCCK2Refficientlyandanalysisofitsanti-tumoractivityandapplicablegastriccancercase作者姓名：冯小丽专业名称：预防兽医学研究方向：食品质量与安全指导教师：柳增善教授学位类别：农学博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年6月2日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位唐军教授中国农业大学主席钱爱东教授吉林农业

2、大学陈瑞爱教授华南农业大学委员程世鹏教授中国农业科学院钱学娟教授南京农业大学丁壮教授吉林大学张彦明教授西北农林科技大学李建华教授吉林大学肖少波教授华中农业大学杨勇军教授吉林大学刘波教授吉林大学王新平教授吉林大学本研究受教育部高校博士点基金项目（20120061110078）、吉林省科技支撑计划项目（20120966）和国家青年自然基金资助项目资助（8140195）ThisworkwassupportedbytheSpecializedResearchFundforDoctoralProgramofCollegesandUniversities(No.20120061

3、110078),theKeyScience&TechnologyProjectinJilinProvince(No.20120966)andtheNationalNaturalScienceFoundationforYoungScholarsofChina(No.8140195)中文摘要高效靶向CCK2R重组毒素的筛选、抗肿瘤活性及适用病例分析胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，也是人类主要的癌症死亡原因之一。在我国，胃癌的死亡率仅次于肺癌和肝癌。据统计，全球每年新增胃癌病例高达数百万，其中我国占42％左右；全球每年因为胃癌死亡的人数约为80万，中国占35%。常规的胃癌治

4、疗手段包括手术、化疗、放疗、生物免疫治疗等。手术治疗仍是根治胃癌的最好选择，但并不是所有的胃癌患者都可以进行手术，而且术后容易复发和转移，预后较差；化疗和放疗对胃癌的辅助治疗具有重要意义，但其副作用太大，很容易破坏患者的免疫系统；生物免疫治疗如肿瘤疫苗，多数还处于研发或临床试验阶段，治疗效果还未可知。近年来，分子靶向治疗成为肿瘤治疗领域的一个新热点，它符合胃癌异质性明显、生物学行为复杂等特点。分子靶向治疗通过特异性靶向或调节肿瘤细胞上异常表达的标志性分子，阻断信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭或转移，和放化疗等传统治疗手段相比具有特异性强、选择性高等优点。本

5、实验的主要目的是构建并筛选一种靶向胆囊收缩素II型受体（CCK2R）的重组毒素，通过细胞毒性试验及动物试验获得该重组毒素的杀细胞活性、抗肿瘤活性、毒理及安全性等成药性评价，确定其临床应用价值，并初步建立该重组毒素临床适用病例的分析方法，为临床试验奠定基础，同时为设计胃癌的个性化治疗方案提供指导。本实验室前期根据CCK2R在正常细胞与肿瘤细胞上表达量和亲和力的巨大差异，以酰胺化的胃泌素17（G17）为导向与截短并经修饰的绿脓杆菌外毒素（PE38）重组构建了一种能靶向胃癌的免疫毒素rG17PE38。为了筛选出分子量更小，活性更好的重组毒素，我们利用基因工程手段分别以正向

6、及反向的N端截短的G17（G13、G14、rG13、rG14）及N端延长的八肽胆囊收缩素CCK8（CCK9、CCK12、rCCK9、rCCK12）为导向与PE38融合构建了8种重组毒素。这8种重组毒素在大肠杆菌中均以可溶性形式表达，但是细胞毒性实验表明只有以反向的rG13、rG14、rCCK9和rCCK12为导向构建的4种重组毒素对几种胃癌细胞系I和结肠癌细胞系具有杀伤活性，而且它们和rG17PE38相比，无论在表达量还是杀细胞活性上都没有表现出优势，因此我们最终确定用rG17PE38进行后续实验。采用粗略纯化与精细纯化相结合的方式，对rG17PE38进行了纯化。首

7、先用饱和硫酸铵沉淀法去除大部分杂质，然后依次采用疏水层析、离子交换层析进行精细纯化，最后用凝胶过滤层析脱盐。对饱和硫酸铵沉淀的条件（硫酸铵饱和度、pH值、沉淀时间等），层析条件（层析介质、缓冲液pH、盐浓度等）进行了优化。从纯化结果看，经40%饱和硫酸铵沉淀后，rG17PE38的纯度大约可达50%左右；经过疏水层析和离子交换层析后，纯度可达92%左右；最后经过脱盐处理后，终纯度达95%左右，满足后续实验要求。为了便于保存，我们对纯化后的rG17PE38进行冻干，并优化了冻干条件；然后采用CCK-8毒性检测试剂盒对冻干后的目的蛋白进行活性和稳定性分析；用间接免疫荧