抗烟草花叶病毒（tmv）蛋白y3基因的克隆与原核、真核表达研究

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1、分类号:密级：UDC：学号：405604612028南昌大学硕士研究生学位论文抗烟草花叶病毒(TMV)蛋白Y3基因的克隆与原核、真榡表达研究Studyonanti-tobaccomosaicvirus(TMV)proteingeneofY3cloningandprokaryotic,eukaryoticexpression李恒培养单位（院、系）：生命科学学院生物技术系指导教师姓名、职称：吴丽萍副教授中请学位的学科门类：理学学科专业名称：微生物学论文答辩FI期：2015年5片31日2015年5月曰一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行

2、的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）:；

3、(

4、屯签字R期：>^年<月

5、R二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以

6、采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：；

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8、[&导师签名（手写）：签字円期：年（月I円签字R期丨S年<月论文题目姓名学号论文级别博士□硕士s/院/系/所/冬备专业联系电话Email通信地址(邮编)：备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，______年_月后公开)摘要摘要植物病毒病是由植

9、物病毒引起的对农业生产造成严重影响的一类重要病害，目前尚未有高效的抗病毒制剂，尤其是天然抗病毒制剂来防治植物病毒病。研究发现食用菌中含有许多具有独特功能的生物活性蛋白，如核糖体失活蛋白（RIP）、抗动植物病毒蛋白、凝集素等，它们具有很强的抗肿瘤、抗动植物病毒、抗真菌、免疫调节等生物活性，这为日益严重的植物病毒病害提供了新的防治途径。Y3是从食用菌毛头鬼伞（Coprinuscomatus）中发现的对烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）具有一定抑制作用的蛋白，此蛋白呈碱性，在体外稳定性高，利于开发，具有潜在的应用价值。本试验对其基因序列及原核

10、、真核表达特性进行了研究，其结果如下：(1)通过克隆得到一段1000bp的蛋白y3基因的全长DNA序列和530bp的cDNA序列。利用NCBI中的BLAST同源检测，发现DNA序列只有与抗TMV蛋白Y3部分DNA序列有最大的同源性，GenBank登录号为HM204931.1，最大同一性（Maxidentity）为94%；cDNA序列则包括1个最大长度为393bp的ORF，该最大ORF推测可编码1个含有130个氨基酸的多肽链，将其与NCBI上的蛋白y3部分cDNA序列进行比对，一致性达到95.69%。同时比对y3基因的DNA序列和cDNA序列，发现二者序列的同一性

11、（Identity）达89.96%，几乎完全配对，说明本试验所得到的两种序列具有很高的同源性，进一步说明本试验得到的DNA和cDNA序列均是目的序列。(2)设计带有限制性酶切位点Bamh1和Xho1的引物，以获得的530bp的cDNA序列为模板进行PCR，再将PCR产物与载体PET28a(+)连接构建原核表达载体PET28a(+)-y3，诱导表达的蛋白经纯化后采用半叶法测定其抗病毒活性，表明当y3蛋白浓度为12.5μg/ml时，对TMV侵染抑制率为70.22%＋1.25%，说明本试验通过原核表达得到的y3蛋白液还是具有比较好的抗TMV活性的，但是低于直接从毛头鬼

12、伞子实体中提取的y3蛋白的抗TMV活性，说明原核表达系统存在着一定的不足和缺陷，还需要进一步探索更好的蛋白表达系统。(3)以带有酶切位点SnaBⅠ和NotⅠ的序列为引物，以获得的530bp的cDNA序列为模板进行PCR，将获得的目的片段与T-载体连接、转化、提取后再与真核表达载体pPic9k连接转化入酵母感受态细胞，经甲醇诱导表达后得到Ⅰ摘要抗TMV蛋白Y3。通过摸索接种比例、甲醇浓度、pH值、摇床转速、诱导时间等培养条件对蛋白Y3表达的影响，经过正交试验优化确定了较优发酵条件：将+Mut转化子接种于BMGY生长培养基上，培养至OD600=5.0，离心后以1.5

13、:1的接种比例转移到含有