tsc1和tsc2蛋白的表达、纯化和性质探讨

《tsc1和tsc2蛋白的表达、纯化和性质探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海交通大学硕士学位论文TSC1和TSC2蛋白的表达、纯化和性质探讨硕士研究生：何爱梁学号：1130809070导师：吴更教授申请学位：学术型硕士学科：生物学所在单位：生命科学技术学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：上海交通大学DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterRESEARCHONEXPRESSION,PURIFICATIONANDPROTEINFEATUREOFTSC1ANDTSC2Candida

2、te：AiliangHeStudentID:1130809070Supervisor：Prof.GengWuAcademicDegreeAppliedfor：AcademicMasterSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandBiotechnologyDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：ShanghaiJiaoTongUniversity上海交通大学硕士学位论文TSC1和TS

3、C2蛋白的表达、纯化和性质探讨摘要结节性硬化症（TuberousSclerosisComplex，TSC）是一种在多器官发生良性肿瘤的常染色体显性疾病。该疾病表现出多种临床病症，如癫痫、自闭症、肾血管平滑肌瘤等。结节性硬化症由肿瘤抑制基因TSC1和TSC2发生突变所致，不同突变导致的病症和严重程度都不同。这两个基因分别编码的TSC1和TSC2蛋白形成TSC1/2复合物，在mTOR信号通路中起到负调控的作用。TSC1/2复合能够整合上游的氨基酸、生长因子、能量、低氧和细胞因子等生长信号，转化为TSC1和TSC

4、2不同位点的磷酸化状态。TSC2的GTP酶激活蛋白（GAP）结构域活化Rheb（RashomologenrichedinbrainGTPase），从而抑制mTORC1（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1，mammaliantargetofrapamycincomplex1）的活性，降低细胞的合成代谢水平。该复合物的结构学研究有助于揭示其调控机理。本研究表达和纯化人和裂殖酵母Schizosaccharomycespombe（S.pombe）的TSC1和TSC2蛋白，进行结晶尝试。我们利用大肠杆菌Escherich

5、iacoli（E.coli）表达TSC1的coiledcoil结构域和TSC2的GAP结构域，裂殖酵母TSC1540-675aa的MBP（麦芽糖结合蛋白）融合蛋白表达较好，但聚合度高；TSC2完整的GAP结构域沉淀，人TSC21516-1708aa可溶，但与人Rheb共点晶不结晶。用昆虫细胞Sf9共表达裂殖酵母TSC1和TSC2蛋白，TSC1全长（TSC1FL）和TSC2全长（TSC2FL）表达量低；TSC1的C端截短，如1-799aa、1-718aa表达量较高；TSC2的C端截短表达量不如TSC2FL；A

6、nti-Flag亲和纯化Flag-TSC2同时拉出His-TSC1，可得到纯度高的TSC1/2复合物，解决了TSC1表达量高于TSC2的问题；TSC1需要一定长度的coiledI上海交通大学硕士学位论文coil来稳定TSC2，部分C端截短的TSC11-718aa或1-799aa和TSC2FL共表达有利于提高TSC2的表达量。裂殖酵母TSC1以二聚体的形式存在；TSC1结合TSC2，TSC1/2复合物会聚合成分子量大于1MDa的多聚体；TSC2的N端和GAP结构域可以分开，TSC1和TSC2的N端结合。Exp

7、i293F表达系统适合人TSC1FL和TSC2FL的表达，但表达量较低，截短蛋白的表达情况不如全长。总之，本研究对TSC1和TSC2的表达和纯化进行了深入的探索，阐释了蛋白的一些结构性质，研究结果和提出的方法为TSC1和TSC2的结晶研究奠定了重要基础。关键词：TSC1，TSC2，裂殖酵母，昆虫细胞表达，纯化II上海交通大学硕士学位论文RESEARCHONEXPRESSION,PURIFICATIONANDPROTEINFEATUREOFTSC1ANDTSC2ABSTRACTTuberoussclerosi

8、scomplex(TSC)isanautosomaldominateddiseasecharacterizedwithbenigntumorsdevelopedinmultipleorgans.Thisdiseasehasvariousclinicalmanifestations,suchasepilepsy,autismandrenalangiomyolipoma.TheoccurrenceofTSCresul