内皮抑素抗血管生成基因治疗子宫内膜异位症实验的研究

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1、博士学位论文内皮抑素抗血管生成基因治疗子宫内膜异位症的实验研究博士研究生：马颖指导教师：何援利教授摘要目的子宫内膜异位症(Endometriosis，EM，内异症)是女性常见疾病，主要引起不孕、痛经、性交痛及慢性盆腔痛等症状。子宫内膜异位症虽是一种良性疾病，却具有类似肿瘤的恶性特征，例如局部浸润、远处器官受累和多发病灶等恶性行为。本病难以根治，复发率高，严重影响患者的身心健康。目前治疗应用的药物主要为激素类，然而这些药物容易出现肝功能损害、骨质疏松、潮热和心绪烦躁等严重副作用，连续使用不宜超过6个月。此类药物大都以雌激素作为治疗靶点，通

2、过拈抗作用或抑制卵巢分泌等途径直接或间接降低体内雌激素水平，从而促使异位内膜病灶的萎缩来达到治疗目的，但这仅是针对病因的一方面进行治疗，而且一旦停药，随着雌激素水平的恢复，相当多患者的病情会复发。手术治疗子宫内膜异位症，对于病灶的祛除、盆腔解剖的恢复有一定作用，但在轻、中度内异症、不孕和复发患者，手术的价值仍存在一定争议。同时，手术后加用药物治疗虽在短期内可能提高治疗效果，但仍不能避免或减少术后复发。因此，疾病的复发仍然是目前子宫内膜异位症治疗的难点。其原因在于发病机制的不确定，缺乏以病因为靶点的治疗方法。因此，追踪内异症发病机制的最新

3、研究进展，从中寻找一条新的治疗途径已经成为当前研究的迫切需要。对于内异症的发生机理，目前大多数学者认可Sampson的经血逆流学说。经血逆流现象虽很普遍，发生率高达76％～90％，但与内异症的发生并无明显中文摘要的因果关系，说明经血逆流可能只是诱因或基础。当脱落的子宫内膜组织附着在腹膜或其它部位时，异位内膜组织本身及其周围组织新的血供的建立和维持，才是异位子宫内膜组织种植、存活和内异症发生的基本条件。因此可以说，异位子宫内膜组织的转移、种植、生长等类似肿瘤转移的生物学行为，是内异症发病的关键。异位子宫内膜病灶的形成及生长必须依赖新生血管

4、的形成，血管生成机制已成为内异症公认的重要发病机制。目前已有学者尝试用血管生成抑制因子针对内异症进行有关抗血管生成治疗的研究，初步显示了良好效果。因此，抗血管生成可能成为治疗内异症的有效途径。人内皮抑素(Endostatin，Endo)是一种内源性血管生成抑制因子，具有强烈的抑制新生血管形成的能力，抑制效应和特异性都优于血管抑素。内皮抑素特异性地抑制血管内皮细胞增殖，而且只抑制新生血管内皮细胞，对平滑肌细胞和肿瘤细胞等非内皮起源的细胞无明显抑制作用，对正常的成熟血管内皮细胞的抑制作用也极弱。由于内皮细胞具有良好的遗传稳定性，不易发生突变

5、，既大大提高了治疗的安全性，又减少了耐药性的发生。因此，内皮抑素具备了用于抑制肿瘤或其他疾病血管生成的诸多先天优势。目前动物实验显示体内注射内皮抑素蛋白或基因可抑制肿瘤的生长和转移，同时，治疗期间都没有发现任何毒副作用和耐药性，而且治疗停止后肿瘤仍一直处于休眠状态。内皮抑素抗血管形成治疗国外已进入到II期临床阶段，国内也有用内皮抑素蛋白或基因抗血管生成治疗的动物实验研究。但内皮抑素应用研究局限于肿瘤治疗，尚未有用于子宫内膜异位症治疗方面的研究报道，因此，本课题就内皮抑素在内异症治疗中的效果及安全性进行了研究。蛋白治疗和基因治疗是目前最常

6、用的治疗方法。蛋白治疗具有一些难以克服的缺陷，如治疗剂量大、血药浓度维持时间短、需反复注射、所需疗程长以及可能传播毒性和感染颗粒等，造成蛋白治疗严重受限。而基因治疗则可克服这些缺点，与机体自然生理过程比较吻合，因此，基因治疗是未来治疗的重要趋势。选择理想的载体系统，将目的基因高效、安全地导入宿主细胞并使之高效表达，Ⅱ博士学位论文是基因治疗成功的关键。腺病毒载体是临床基因治疗研究中应用最为广泛的载体之一，与其他基因治疗载体相比，具有以下优点：①宿主范围广，对人致病性低，可广泛用于人类及非人类蛋白的表达；②能在增殖和非增殖细胞中感染和表达基

7、因；③腺病毒载体能进行有效的增殖，产生较高的病毒滴度，非常适用于基因治疗；④其与人类基因同源，可使大多数人类蛋白都达到高水平表达并具有完全的功能；⑤不会像逆转录病毒那样随机整合到宿主染色体，进而导致基因失活或激活癌基因，它在染色体外表达，无插入致突变性。因此，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。本课题拟通过分子生物学、实验动物学、病理学和免疫学的相关技术，利用改进的携带绿色荧光蛋白的AdEasy-1腺病毒载体系统，构建携带人内皮抑素基因的重组腺病毒，包装、扩增、纯化后，体外感染人脐静脉内皮细胞，诱导其

8、发生凋亡；建立人内异症裸鼠皮下种植及腹腔注射模型，研究其血管生成特性，并用重组腺病毒局部注射裸鼠异位子宫内膜病灶，观察内皮抑素抑制异位内膜病灶生长情况以及可能出现的毒副反应，研究内皮抑素基因治疗内异症的可行