骨肉瘤抗原PBF+HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的预测与鉴定

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1、单位代码10475申请编号分类号硕士学位论文（同等学力）骨肉瘤抗原PBFHLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的预测与鉴定学科、专业：临床医学研究方向：骨外科学申请学位类别：医学硕士申请人：吴威指导教师：杜耀武二〇一七年六月TumorantigenPBFofHLA-A*0301-restrictedcytotoxicTlymphocyteepitopepredictionandidentificationADissertationsubmittedtotheGraduateschoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheReq

2、uirementsfortheDegreeofMasterofMedicineBySupervisor:AssociateProfessor.YaowuDuJun.2017I摘要背景骨肉瘤是骨中最常见的原发性恶性肿瘤。骨肉瘤患者的生存率在1970年以前低于20％。辅助化疗，手术切缘的准则的建立，和切除后重建的发展使患者五年存活率提高为60％-70％。这些进展掩盖了使用自体肿瘤疫苗用于骨肉瘤患者的开创性辅助免疫治疗试验，尽管这些实验具有一定的治疗功效。然而，骨肉瘤患者的存活率在过去十年已经进入停滞期，这又重新激起了免疫治疗方法的兴趣。目前，越来越多的认识到，主动免疫治疗作为手术

3、，化疗和放射治疗后治疗恶性肿瘤的第四种治疗方式。在临床试验中，使用CTL识别的肿瘤相关抗原的鉴定和衍生抗原肽疫苗制剂的方法，使恶性黑素瘤和其他患者的肿瘤消退。目的此次研究的主要目的是鉴定高表达于骨肉瘤细胞中的抗原PBF的HLA-A3限制性CTL表位。方法首先，通过预测工具NetCTL1.2，BIMAS和SYFPEITHI对PBF的HLA-A3限制性进行表位预测。所筛选出来的表位肽的合成方法使用标准的Fmoc的方法进行合成，通过使用高效液相色谱进行纯化后，再使用质谱进行分析鉴定，所得到的结果用来证实分子量是否符合理论值。通过使用T2A3细胞的结合力检测候选肽与MHC分子的结和力

4、，ELISPOT和LDH实验等检测表位肽诱导CTL的能力。结果1.综合以上表位预测结果的软件，此次实验初步筛选了六个天然表位肽：P104(VTVWLLEQK)，P143(ALAYRPVSR)，P263(LLDEPAPRK)，P273(KNSVKVMYK)，P294(IVGIKRHVK)，P463(HLIVTSPPR)之后进行Fmoc固相合成，使用质谱分析鉴定表位肽理论分子量。2.候选表位P143、P263、P273、P294、P463结合力较高。3.候选表位的体外实验。①ELISPOT结果显示P143、P263、P273、P294、P463表位肽都能分泌较多的IFN-γ。②体

5、外细胞毒活性实验中，CTL体外杀伤结果II显示：P263、P294、P463对靶细胞荷肽T2A3产生杀伤作用。结论1.天然表位肽P143、P263、P273、P294、P463显示出了较强的结合力。2.用HLA-A3+健康供者外周血单核细胞，结果显示P143、P263、P273、P294、P463表位肽都能分泌较多的IFN-γ；LDH细胞毒性实验显示P263、P294、P463诱导的CTL具有能够有效杀伤靶细胞荷肽T2A3的能力。3.P263、P294、P463可能是骨肉瘤PBF抗原的HLA-A3限制性CTL候选表位。关键词:表位疫苗；CTL表位；PBFIIIABSTRACT

6、Background:Osteosarcomaisthemostcommonprimarymalignanttumorofbone.Thesurvivalrateofpatientswiththisdiseasewasunder20%before1970.Sincethen,theintroductionofneoadjuvantchemotherapy,establishmentofguidelinesforadequatesurgicalmargins,anddevelopmentofpostexcisionreconstructionhaveraisedthe5-yea

7、rsurvivalrateto60–70%.Theseadvancesovershadowedthepioneeringadjuvantimmunotherapytrialsusingautologoustumorvaccinesforpatientswithosteosarcomadespitetheirhavingsometherapeuticefficacy.However,thesurvivalrateofpatientswithosteosarcomahasreachedaplateauint