睾酮时间分辨荧光免疫检测试剂及降钙素原胶体金半定量免疫层析检测试剂的研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文皋酮时间分辨荧光免疫检测试剂及降钙素原胶体金半定量免疫层析检测试剂的研究DevelopmentofDiagnosticReagentsforHumanTestosteroneUsingTime—resolvedFluoroimmunoassayandforHumanProcalcitoninUsingSemi-quantitativeColloidalGoldImmunochromatographyAssay课题来源：企业委托课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员郝芬李明教授免疫学非定向博士生物技术学院朱家

2、勇余新炳何灰瑜曾令文裘宇容杨晓明吴英松教授2013年5月29日广州博士学位论文～～／㈣烨睾酮时间分辨荧光免疫检测试剂及降钙素原胶体金半定量免疫层析检测试剂的研究博士研究生：郝芬指导教师：李明教授摘要研究背景及目的免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为示踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定的方法。时间分辨荧光免疫分析(Timed．resolvedfluoroimmunoassay

3、，TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术，是以镧系稀十离子作为标记物来标记抗原或抗体，因镧系稀土离子具有独特的荧光特性，该技术能够获得极高的信噪比，从而具有很高的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。时问分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高的临床应用价值。该技术适用于各种抗原抗体的临床检测，在市场上已得到广泛应用。睾酮作为性激素的一种，是临床激素六项检测中的重要组成部分，目前临床上常用的睾酮检测试剂主要是PE公司生产的时间分辨睾酮检测试剂及进口的化学发光法睾

4、酮检测试剂，于是开发国产的睾酮检测试剂成为我们关沣的焦点。摘要睾酮由于是甾类激素，属小分子半抗原，98％的睾酮分子在血清中均是以与激素结合蛋白结合的状态存在，这些特殊性均为睾酮定量检测试剂的研发工作带来了困难与挑战。因此，在睾酮试剂的研制过程中，我们将异源桥式搭配理念引入研制过程中，以睾酮的结构类似物雄烯二酮为载体，在其C3位引入含有五个亚甲基的臂，在此结构基础上合成NHS活泼酯，其与BSA偶联后进行Eu标记从而作为反应体系中的示踪物，在以一步间接竞争法的模式基础上研制了此试剂用于血清、血浆中睾酮含量的测定。胶体金免疫层析是建立在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术和免疫胶

5、体金标记技术基础上的以胶体金为标记物，利用特异的抗原抗体反应来放大反应，通过直接观察就可以判定结果的新技术。该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，在临床医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测诸多诊断领域迅速发展[1]。随着即时检验(POCT)产业的深入发展，胶体金试剂由于其本身所带有的快速、简便、易于携带、便于深入社区及边远山区等特点，成为目前POCT发展的主要领域，从而那些与发病急、危害大的疾病相关的检测指标的胶体金试剂的需求越来越大。降钙素原(PCT)作为一种与脓毒血症相关的特异性检测指标，只有当细菌感染时降钙素原才会升高，在其他的炎性反应巾如病毒感染、自身

6、免疫性疾病和创伤等均不会升高，所以其具有良好的特异性及灵敏度，能用于区分感染或非感染引起的炎症、器官功能障碍以及休克。从产生和消除的动力学过程来看，PCT也是最适合用作临床诊断指标的。加之脓毒血症能够在短时间内对病人的生命造成严重威胁，故其检测试剂的胶体金化也成为临床医生及诊断试剂厂家的关注的重点。但是目前检验领域仅有几家公司有相关试剂的生产能力，国内厂家几乎属于窄白状态，大部分医院所使用的相关检测试剂全部依赖进口，如Braham公司生产的半定量PCT试剂，但其所具有的一个重要的缺陷是价格昂贵，无法满足社区与边远山区医疗需求，故研制国产的PCT胶体金半定量试剂成为我们的主要目标。国产

7、PCT试剂一直寥寥无几的主要原因是没有性能优越的原lJ博士学位论文料，大部分存在灵敏地低或特异性差的问题。为了更好的解决原料问题，我们对市售的PCT抗体进行了大规模的搜索工作，利用时间分辨免疫荧光检测进行原料配对等初筛工作，并且发现了满足半定量胶体金试剂研发要求的原料在TRFIA荧光值方面的特殊性，最终通过双抗体夹心法研制了能够进行PCT半定量检测的胶体金试剂。本文主要从制备翠酮及睾酮类似物的化学衍生物及其偶联物、睾酮时间分辨免疫荧光检测试剂的研究及降钙素