资源描述：
《hsv1-tk%2ffiau报告基因系统心脏spect显像实验的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、华中科技大学博士学位论文摘要目的构建携带单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因（herpessimplexvirus1-thymidinekinase,HSV1-tk）的重组腺病毒载体（Ad5-tk）并将其转染动物心肌，通过在体放射性自显影（autoradiography，ARG）及单光子发射计算机断层（singlephotonemissioncomputedtomography,SPECT）显像研究探讨用氟-碘阿糖基脲嘧啶131131（I-2’-fluoro-2’-deoxy-1-β-D-arabinofuranosyl-5-io
2、douracil，I-FIAU）作为报告探针，用HSV1-tk作为报告基因心脏显像的可行性，并探讨显像所需病毒滴度及显像的时间过程，为此报告系统应用于人类的心脏报告基因显像提供理论基础。方法1．重组腺病毒的构建及鉴定以含巨细胞病毒（CMV）启动子的pDC316为载体质粒，将报告基因HSV1-tk插入多克隆位点，构建重组质粒pDC316-tk,以pDC316-tk作为重组穿梭质粒，与腺病毒（Adenovirus,Ad）骨架质粒共转染293细胞，包装生成腺病毒重组体Ad5-tk,本部分与北京本元正阳公司合作完成。1312．I-
3、FIAU的标记及质量鉴定利用Iodogen固相氧化法对FAU进行碘化标记，标记产物用Sep-PakC-18反相层析色谱小柱进行纯化及标记率分析，TLC-SG硅胶板薄层层析法测定标记产物的放131射化学纯度，并观察I-FIAU在37℃新鲜正常人血清中放置4h、12h和24h后的体外稳定性。3．大鼠心肌报告基因表达的放射性自显影SD大鼠心肌内注射Ad5-tk。根据目的不同进行分组如下：①转染报告基因后时8131间对显像的影响：心肌内转染1×10pfuAd5-tk后第1、2、3、5、7d注射I-FIAU。88②不同转染滴度对显像
4、结果的影响：心肌内注射不同滴度的Ad5-tk(5×10pfu,1×106PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.fineprint.cn华中科技大学博士学位论文77131pfu,5×10pfu,1×10pfu)，2d后注射I-FIAU。对照组均采用注射同体积的空载腺病131毒（Ad5-null）。所有动物在注射I-FIAU24h后断颈法处死，取出心脏，测量γ计数值，行ARG研究，RT-PCR和免疫组织化学分别从mRNA水平和蛋白水平证实HSV1-tk基因表达，并对ARG图像和RT-PCR图像行半定量
5、分析,探讨体内ARG图像上ROI的T/NT与体外γ计数及基因表达的mRNA水平间的相关性，寻求获得最佳图像的转染滴度及基因表达时间。4．家兔心肌报告基因表达的SPECT显像家兔心肌内注射Ad5-tk，根据目的不同进行分组如下：①转染报告基因后不同时988间对显像结果的影响：家兔心肌内注射不同滴度的Ad5-tk（1×10pfu,5×10pfu,1×1077131pfu,5×10pfu,1×10pfu），2d后耳缘静脉注射I-FIAU600µCi，于注射后6h、24h、948h和72h行心肌SPECT显像，注射1×10pfuA
6、d5-tk的家兔继续行96h和120h显9像；②不同Ad5-tk滴度对显像结果的影响：家兔心肌注射不同滴度的Ad5-tk（1×108877131pfu,5×10pfu,1×10pfu,5×10pfu,1×10pfu），2d后耳缘静脉注射I-FIAU600µCi行6h、24h和48h心肌SPECT显像。对照组均采用注射同体积的无菌生理盐水。第二组动物显像结束后处死，取出心脏，测量γ计数值，行RT-PCR及免疫组织化学研究，对SPECT和RT-PCR图像行半定量分析，并对各半定量指标间的相关性进行分析，寻求活体内获得SPECT
7、报告基因表达显像所需转染病毒的最佳剂量及获得最佳图像质量的时间过程。结果1．重组腺病毒的构建及鉴定与本元正阳公司协作构建的重组质粒pDC316-tk经PCR、酶切鉴定和测序鉴定证12明序列正确，包装生成的重组腺病毒Ad5-tk的物理滴度（v.p./ml）为1.1×10，感染滴10度（TCID50/ml）达到1.6×10。1312．I-FIAU的标记及质量鉴定Iodogen固相氧化法能有效标记FAU；标记产物用Sep-PakC-18反相层析色谱小柱7PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.finepr
8、int.cn华中科技大学博士学位论文进行纯化并测得的标记率为(53.82±2.05)%(n=5)，TLC-SG硅胶板薄层层析法测定标记131产物的放射化学纯度为(94.85±1.76)%(n=5)，I-FIAU在37℃血清中放置4h、12h和24h后的放射化学纯度大于90%。3．大鼠心肌报告基因表达的放
