FIAU用于心脏报告基因显像的实验的研究

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1、·华中科技大学硕士学位论文FIAU用于心脏报告基因显像的实验研究摘要目的制备125I-FIAU，培养原代心肌细胞，构建含HSV1-tk的腺病毒重组体，通过一系列实验评价心肌细胞对该腺病毒重组体的易感性及感染后的活力，评估感染滴度及感染时间对心肌细胞体外摄取125I-FIAU的影响，为进一步探讨用腺病毒作为载体、HSV1-tk作为标志性基因、放射性核素标记的FIAU作为标志性底物进行心脏报告基因显像的可行性打下基础。方法1.FAU的碘化标记及其在昆明小鼠体内的生物分布研究利用Iodogen固相氧化法碘化标记FAU，

2、标记反应产物用Sep-PakC18反相色谱柱进行纯化，用硅胶板薄层层析法测定125I-FIAU的放射化学纯度和体外稳定性，并研究其在昆明小鼠体内的生物分布情况，着重分析在心肌及血液中的分布特性。2.原代SD大鼠乳鼠心肌细胞的培养及鉴定取1～3d龄的SD大鼠乳鼠的心室组织，切成1mm3的小块采用含牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）的Ⅱ型胶原酶单次消化心肌，1h后用差速贴壁法纯化心肌细胞后培养，全过程在25℃-37℃条件下进行。在生物倒置显微镜下动态观察培养的心肌细胞的形态，用免疫组织化学染

3、色的方法进行纯度测定。3.Ad-CMV-HSV1-tk重组体的制备及鉴定用HSV1-tk作为报告基因，用巨细胞病毒作为启动子，腺病毒作为载体，构建腺病毒重组体，本部分与北京本元正阳公司合作。3····华中科技大学硕士学位论文1.感染Ad5-tk的心肌细胞活性及感染滴度和感染时间对其体外摄取125I-FIAU的影响。应用腺病毒重组体将HSV1-tk基因转染到心肌细胞中，用MTT的方法评价心肌细胞感染病毒重组体后的活力，分析细胞活力与感染滴度的关系；用RT-PCR的方法监测心肌细胞感染病毒重组体后有无HSV1-tkm

4、RNA存在，并在更换含125I-FIAU的培养基后分别于0.5h、1h、2h、3h、4h、5h时测定不同感染滴度下的心肌细胞对125I-FIAU的摄取率，分析摄取率与感染滴度和感染时间的相关性。结果1.Iodogen固相氧化法能有效碘化标记FAU，标记反应产物经Sep-PakC-18反相色谱柱纯化后，125I-FIAU的放射化学纯度为98.60%±0.52%（n＝5）；125I-FIAU在正常人血清及PBS中37℃条件下稳定，在0.5h～24h的时段内放射化学纯度>95％。生物分布实验显示，125I-FIAU从血

5、液中清除迅速，肾脏是主要排泄器官，心肌24h后几乎无滞留。2.用含牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）的Ⅱ型胶原酶单次消化心肌，心肌组织在6h时基本消化完全。5、10、15、20、25和30天时台盼兰染色法计算得到心肌细胞存活率均大于95％，30d时仍为95.2％；生物倒置显微镜下观察，24h左右心肌细胞之间形成交联，并有细胞搏动；培养48h的细胞经免疫组织化学染色法测定心肌细胞纯度为(97.1±1.9)％。3.与本元正阳公司协作构建腺病毒重组体，pDC316-tk质粒经PCR、酶切鉴定和

6、测序鉴定证明序列正确，得到Ad-CMV-HSV1-tk腺病毒重组体的物理滴度为1.1×1012，感染滴度达到1.6×1010。4.MTT实验结果显示，心肌细胞感染腺病毒重组体后的活力与感染滴度存在负相关的关系；RT-PCR结果显示，心肌细胞感染腺病毒重组体后有HSV1-tkmRNA存在。摄取率结果显示，腺病毒重组体感染后的心肌细胞体外对125I-FIAU的摄取率与感染滴度和感染时间呈明显正相关关系。4····华中科技大学硕士学位论文结论用Iodogen固相氧化法和Sep-PakC-18反相色谱柱纯化可以快速制备符

7、合实验要求的125I-FIAU，并且所制备的125I-FIAU具有较好的生物分布特性。应用改良的方法可以更简单的培养出符合大多数实验要求的心肌细胞。用腺病毒重组体做载体，可以将HSVI-tk基因成功转导入心肌细胞，并且对125I-FIAU有较高的摄取率。因此，用腺病毒重组体作为载体，HSV1-tk作为标志性基因，125I-FIAU作为标志性底物有望进行心脏报告基因显像。关键词FAU；同位素标记；药代动力学；报告基因；心肌5····华中科技大学硕士学位论文ExperimentalStudyofCardiacRepo

8、rterGeneImagingwithFIAUAbstractObjectiveTheaimofthisstudywastoevaluatethepossibilityofHSV1-tkwhichwastransducedbyanadenoviralvector,andradiolabledFIAUasamarkergene/markersubstrateforimagi